TÉCNICAS CITOLÓGICAS

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1 Psicologia e Saúde Unidade curricular: Biologia Humana I 6ª aula PL TÉCNICAS CITOLÓGICAS INTRODUÇÃO: Entende-se por técnicas citológicas o conjunto de operações a que é preciso submeter o material biológico para ficar em condições de ser observado ao microscópio. Estas técnicas podem ser divididas em dois grandes grupos de preparações: para microscopia óptica e para microscopia electrónica. Microscopia óptica São variados os métodos de preparação de material citológico para ser observado ao microscópio óptico. Podemos considerar 3 grandes tipos de preparações: I. Preparações a fresco ou extemporâneas II. Preparações definitivas sem inclusão III. Preparações definitivas com inclusão (inclusão é uma das etapas da técnica, que consiste em colocar a peça citológica num bloco constituído por uma substância protectora e de suporte, que permita efectuar facilmente o corte) I - Preparações a fresco É um tipo de preparação que pode ser utilizada a qualquer momento, porque permite uma observação rápida e imediata. Também é designada por preparação extemporânea. A este tipo de preparação se devem as primeiras descobertas científicas, pois permite a observação de peças ou microorganismos em condições de vida, apesar de ser por um curto período. Habitualmente, uma preparação é constituída por uma lâmina de vidro na qual se coloca o material biológico a observar, sobrepondo-se a este uma lamela de vidro. Por vezes usam-se outros tipos de lâminas na observação de preparações a fresco, como as lâminas escavadas, que têm no centro uma cavidade. O material fica, assim, rodeado de maior quantidade de líquido e ao mesmo tempo não há compressão da lamela sobre as estruturas a observar.

2 Observação in vivo e in vitro A observação in vivo corresponde ao estudo das células no seu próprio meio. É um método muito utilizado para o estudo dos seres vivos de pequenas dimensões (protozoários e bactérias). A observação in vitro permite o estudo das células vivas, sendo estas previamente retiradas do meio natural em que vivem e colocadas em soluções com composição química bem definida, de forma a que se processe sem qualquer alteração o metabolismo celular. A Líquidos fisiológicos Quando há a preocupação de se observar todas as manifestações vitais do material em estudo, procura-se rodear a peça de líquidos favoráveis à sua vivência, cuja osmolaridade deve igualar aquela em que o ser vivo habitualmente vive. Esses líquidos ou meios denominam-se fisiológicos ou isotónicos e os mais usados são: Líquido fisiológico (artificial) Solução aquosa de cloreto de sódio a 9 /1000, para células de mamíferos e a 7/1000 para células de animais poiquilotérmicos. Líquido fisiológico do tecido sanguíneo (plasma sanguíneo) obtido por coagulação do sangue, seguida de centrifugação, adição anticoagulante, centrifugação e colheita do sobrenadante plasma sanguíneo. Líquido de Ringer geralmente utilizado para exame de células de vertebrados poiquilotérmicos e invertebrados. Além da isotonia, visa fornecer às células os elementos minerais existentes nos meios em que vivem e cuja iria prejudicar o seu metabolismo e estrutura. Esta solução pode apresentar diferentes composições quantitativas, nomeadamente quando são utilizadas em células de animais homeotérmicos (mamíferos e aves) ou poiquilotérmicos. Água do mar ou do rio natural e filtrada ou artificial. B Coloração vital Quando há necessidade de pôr em evidência certas estruturas celulares, procede-se à sua coloração. Os corantes são substâncias que aumentam o contraste e permitem distinguir regiões com igual índice de refracção. Porém, tem de haver uma precaução se queremos que o protoplasma não morra. Para isso são usadas soluções muito diluídas de corantes vitais, tais como: azul de metileno, vermelho neutro, azul do Nilo, vermelho do Congo, azul brilhante de cresilo, verde Janus, castanho de Bismark, azur I, azur II, etc., em concentrações da ordem de 1/ a 1/ Com as colorações vitais não só observamos as células e microorganismos como também granulações de secreção, vacúolos digestivos, grânulos, organelos citoplasmáticos e ainda partes do núcleo como, por exemplo, o nucléolo e cromossomas. 2

3 Muitos corantes coram certas estruturas celulares de uma cor diferente da sua. Estes corantes reveladores de reacções químicas são chamados metacromáticos. Por exemplo: o vermelho neutro, solúvel em água destilada com cor vermelho-violácea, vira para vermelho-cereja sob a influência de vestígios de ácidos e para amarelo-acastanhado ou alaranjado pela acção das bases. Alguns corantes vitais podem mesmo indicar o grupo químico a que pertence um determinado elemento da célula, o que se utiliza em técnicas de histoquímica. Por exemplo, o Sudão III cora as granulações de gordura nas células vivas. Limitações do exame a fresco Só se aplica a materiais suficientemente transparentes A nutrição das células não é suficiente e, dentro de horas, as células começam a mostrar sinais de degenerescência, acabando por morrer. As observações têm, assim, uma duração muito limitada sendo, portanto, preparações efémeras que não se podem conservar. II e III - Preparações definitivas Fixadores São substâncias ou agentes que induzem precipitação (cloreto de mercúrio e ácido pícrico) ou coagulação (aldeído fórmico, tetróxido de ósmio e glutaraldeído) das proteínas, tornando-as insolúveis. Estes agentes são utilizados em técnicas citológicas para inibir a actividade enzimática da célula, para impedir a actividade e a proliferação das bactérias, para endurecer as células de modo a que resistam melhor às etapas seguintes da técnica citológica e para aumentar a afinidade das estruturas celulares pelos corantes citológicos, tornando-as assim mais facilmente coráveis, mantendo-lhes, tanto quanto possível, a sua morfologia e estrutura. Submergindo um pedaço de tecido num líquido fixador, a morte da célula não ocorre instantaneamente. O fixador penetra na peça por difusão, de tal maneira que a maioria das células periféricas fixa mais rapidamente e melhor do que as centrais. A rapidez da fixação depende da barreira proteica que se origina na periferia do tecido. Tipos de fixadores Agentes físicos usados como agentes fixadores: Pelo calor seco (chama, ex.: bactérias) ou húmido (fervura). De um modo geral, são métodos grosseiros e violentos que alteram profundamente a estrutura das células. Dessecação à temperatura ambiente em que há uma rápida evaporação da água das células e dos líquidos intersticiais. 3

4 Agentes químicos usados como agentes fixadores: Metanol, etanol, acetona, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, ácido tricloroacético, ácido pícrico, tetróxido de ósmio, ácido acético, formaldeído, cloreto de mercúrio, etc. Misturas de fixadores mais usados em microscopia óptica Líquido de Bouin (ácido pícrico + formol + ácido acético) Líquido de Carnoy (etanol + clorofórmio + ácido acético) Líquido de Fleming (trióxido de crómio + tetróxido de ósmio + ácido acético + água destilada) Coloração Consiste em corar a totalidade da peça ou algumas partes específicas, dando-lhes tonalidades diferentes. Usam-se soluções de corantes naturais ou artificiais. Corantes naturais - Hematoxilina (extraída de uma leguminosa), Carmin (extraído do ovário da fêmea de um hemíptero), anil (extraído de uma leguminosa), etc. Corantes artificiais Azul de metileno, azul de toluidina, Azur I e II, Sudão, vermelho neutro. Os corantes são geralmente constituídos por misturas de sais, que podem apresentar um ph ácido (ph = 0 6,9), neutro (ph = 7,0) ou alcalino (ph = 7,1 14). Os diversos métodos de coloração assentam na afinidade particular que certos elementos ou estruturas possuem em relação a determinados corantes que sobre eles se fixam electivamente. Tipos de corantes artificiais: Ácidos eosina, fucsina ácida, vermelho do Congo Básicos vermelho neutro, verde de metilo, azul de metileno Neutros eosinato de azur de metileno Consoante a afinidade de determinadas estruturas das células ou tecidos para com um dado tipo de corantes as estruturas podem ser designadas por: Acidófilas se coram com um corante ácido (citoplasma) Basófilas se coram com um corante básico (cromatina) 4

5 Protocolo a efectuar na 6ª aula prática laboratorial (1ª parte) I - Observação de fenómenos de isotonia, turgidez celular, lise celular, plasmólise e desplasmólise Para que a morfologia das células permaneça intacta, devem ser utilizadas soluções isotónicas na observação de células a fresco. Uma solução isotónica é aquela cuja concentração é igual à do meio no qual as células vivem. Quando se utiliza uma solução hipotónica (menos concentrada), a água do meio difunde para o interior das células, aumentando o seu tamanho e provocando turgidez celular. Se esta solução for muito hipotónica, as células podem mesmo sofrer lise celular, uma ruptura em certos pontos da membrana (apenas no caso das células animais). Se, pelo contrário, se utilizar uma solução hipertónica, a água migra do interior das células para o meio extracelular, originando células desidratadas e de menor tamanho, que se dizem plasmolisadas. I A - Observação em células epidérmicas de Allium cepa (n. v. cebola) 1. Cortar uma cebola e, com uma pinça, puxar um pedaço de uma escama delgada e transparente do interior do bolbo. 2. Deitar uma gota de água sobre a lâmina e colocar nela um fragmento da escama de cebola. Cobrir com uma lamela. 3. Observar com a obj. de 10x que não se verificam alterações nas células e seleccionar o campo de observação mais favorável. 4. Após ter verificado este fenómeno de isotonização, fazer penetrar por difusão uma solução de sacarose 1 M (solução hipertónica) com o auxílio de papel de filtro e de uma pipeta (não esquecer que a imagem final obtida no microscópio é invertida). Lentamente, verifica-se uma exosmose e dá-se o fenómeno de plasmólise; observar também com a obj. de 40x. 5. Em seguida, pelo mesmo processo de difusão, retirar a solução de sacarose e fazer penetrar água (sol. hipotónica). Verifica-se uma endosmose e dá-se o fenómeno de desplasmólise. I B - Observação em eritrócitos humanos in vitro 1. Limpar a polpa do dedo indicador com algodão embebido em álcool; deixar secar ao ar agitando o dedo; colocar o dedo para baixo e garroteá-lo com a outra mão, de modo a aumentar a quantidade de sangue na polpa do dedo. 5

6 2. Utilizando uma lanceta estéril, fazer a colheita de uma gota de sangue, a qual sem perda de tempo, se coloca entre lâmina e lamela numa gota de sol. de NaCl 0,9% (soro fisiológico). 3. Focar primeiro com as obj. de 4x e de 10x e observar com a obj. de 40x. 4. Repetir 2 e 3 utilizando uma solução de NaCl 1,5% (sol. hipertónica). Os glóbulos vermelhos tornam-se globosos e eriçados plasmólise (Fig. 11) Fig Eritrócitos na presença de diferentes concentrações de NaCl. 5. Repetir o procedimento utilizando NaCl 0,6%. A célula aumenta de volume devido a uma endosmose, mas a pressão exercida no interior da célula não é suficiente para a fazer rebentar, verificando-se o fenómeno de turgidez celular (Fig. 11). 6. Com uma solução de NaCl 0,4%, a quantidade de água que penetra no interior da célula exerce uma pressão que faz romper a membrana celular, libertando a hemoglobina e ficando a célula mais pálida e transparente, designada vulgarmente por fantasma. (O meio que a rodeia apresenta-se com uma tonalidade avermelhada.) Contudo, a célula mantém a sua forma circular, devido à presença do citosqueleto submembranar, que é responsável pela forma dos glóbulos. O fenómeno de lise celular em glóbulos vermelhos designa-se por hemólise (Fig. 11). Nota: Na célula vegetal não se verifica a lise celular pelo facto de possuir uma parede celular que, não só confere protecção à célula, como faz com que ela suporte pressões elevadas. 6

7 6ª aula prática laboratorial (II parte) III - Preparações definitivas com inclusão Inclusão é uma das etapas da técnica, que consiste em colocar a peça citológica num bloco constituído por uma substância protectora e de suporte, que permita efectuar facilmente o corte. Preparações definitivas com inclusão (técnica usual de microscopia óptica) Etapas: 1. Colheita Cortar em pequenos pedaços, com o auxílio de material de dissecção, o material biológico a fixar. 2. Fixação - Depois da colheita, a peça deve rapidamente ser colocada no fixador para se evitar a autólise e aí permanecer durante algumas horas e, em certos casos, alguns dias ou semanas (em formol, as peças são preservadas indefinidamente). Se necessário, efectua-se uma descalcificação - é a dissolução dos sais de cálcio que se encontram, por exemplo, nos ossos e no exosqueleto de muitos animais. 3. Desidratação - Consiste em substituir a água das células e dos espaços extracelulares de um tecido por um solvente miscível com o solvente do meio de inclusão. Em MO compreende uma passagem pela série ascendente dos álcoois (por ex., 50, 70, 90, 95, 100 I, 100 II, xilol I e xilol II), cujo tempo de passagem varia, de igual modo, com vários factores. Vulgarmente, usa-se 30 a 60 minutos em cada passo. Como nos passos seguintes se utiliza a parafina, que é insolúvel em água mas solúvel em certos compostos orgânicos, é necessário terminar a desidratação com 2 banhos de xilol para substituir o etanol por este solvente da parafina. 4. Impregnação - A impregnação consiste em impregnar os espaços intra- e extracelulares com parafina. Para isso, inicia-se a impregnação com um banho de 1 a 2 horas de duração numa mistura de xilol/parafina (1:1) à temperatura de 55 C (a parafina só fica líquida a esta temperatura). De seguida, a peça histológica é imersa em parafina pura, à mesma temperatura, efectuando-se dois banhos de 1 a 2 horas cada. 5. Inclusão - Nesta etapa é habitual efectuar-se o registo do material processado, ao qual é atribuído um número para posterior identificação. Para se incluir a peça histológica num bloco de parafina utilizam-se moldes especiais, os moldes de Leuckart, que se enchem com parafina líquida, nos quais se introduz a peça histológica e, por último, uma etiqueta. A parafina à temperatura ambiente solidifica e a peça fica assim totalmente incluída na parafina. Nesta etapa procede-se à separação do molde e o bloco fica em condições de 7

8 permanecer armazenado (até por anos, se for caso disso) até se proceder à etapa seguinte, o corte. 6. Corte - É efectuado por meio de uma faca de aço ou de uma lâmina colocada num aparelho especial chamado micrótomo de Minot, no qual se regula a espessura do corte, de acordo com a natureza do tecido e do estudo que se pretende realizar. Na maior parte dos casos utiliza-se o corte com 7 a 8 μm de espessura. 7. Colagem - As secções são coladas numa lâmina de vidro lavada e desengordurada. A colagem efectua-se numa platina aquecida entre 40 e 50 C, utilizando-se água albuminada como cola. 8. Secagem - De seguida as lâminas são colocadas na estufa a 40 C durante 1 a 2 dias para completarem a secagem. 9. Desparafinação - Como os corantes são, de um modo geral, hidrossolúveis, as secções têm de sofrer uma sequência de tratamentos que culmina na sua hidratação. O passo inicial consiste em retirar a parafina. Para este efeito, as lâminas são mergulhadas numa tina de ranhuras com xilol, durante 10 minutos. 10. Rehidratação - Os cortes são transferidos de tina em tina, percorrendo a série descendente dos álcoois até ao álcool a 50, durante 3 minutos em cada passo. Por fim, são colocados em água destilada durante 5 minutos. 11. Coloração - Depois de o material estar bem rehidratado, procede-se à coloração por meio de corantes aquosos. Se o corante for alcoólico deve-se proceder à rehidratação até ao grau da escala do álcool correspondente à riqueza alcoólica do corante. Geralmente, utiliza-se a associação de dois corantes aquosos: as lâminas contendo os cortes são colocadas em tinas de ranhuras contendo hemalúmen (de cor azul arroxeada) durante 10 a 15 minutos. Segue-se uma lavagem em água corrente durante cerca 5 minutos. Depois coram-se nas mesmas condições com a eosina (de cor avermelhada) durante 2 a 3 minutos, seguindo-se uma lavagem durante cerca de 5 minutos. 12. Desidratação - Uma vez corados os cortes, estes têm de sofrer um determinado tratamento que lhes permita serem conservados indefinidamente, o que se consegue através da adição de uma resina transparente. Esta substância é hidrofóbica, logo os cortes têm de ser desidratados (série ascendente dos álcoois) até ao álcool a 100, durante 1 minuto em cada passagem. Por fim, os cortes são diafanizados, o que significa conferir transparência, com xilol durante 3 minutos. 13. Montagem - Após a diafanização, os cortes são cobertos com uma gota do meio de montagem (resina) podendo ser bálsamo do Canadá ou DPX e, por fim, coloca-se uma lamela. O índice de refracção do meio de montagem tem de ser igual ao do vidro. 8

9 14. Secagem, Lutagem e Etiquetagem Para a preparação histológica secar mais rapidamente é colocada na estufa a 40 C, durante 24 horas, para que o meio de montagem endureça. A lutagem é uma etapa muitas vezes não efectuada, que consiste em cobrir os bordos da lamela com um meio totalmente impermeável ao ar. Usa-se geralmente verniz ou betume. Para finalizar, coloca-se num dos lados uma etiqueta, na qual se identifica o material, a fixação e a coloração utilizadas. As preparações devem ser guardadas ao abrigo da humidade e da luz. As etapas da técnica usual da MO irão ser observadas e explicadas através de um filme. Numa das aulas práticas serão executadas as etapas 7 a 14. 9