Introdução à Histologia

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1 Introdução à Histologia Prof. a Dr a. Sara Tatiana Moreira UTFPR Campus Santa Helena 1 Histórico Bichat ( ) Pioneiro da histologia e pai da histologia moderna Sem o uso de microscópio, examinou mais de 600 corpos e identificou 21 tipos de tecidos humanos Com o uso do microscópio 4 tecidos Epitelial Conjuntivo Nervoso Muscular 2 1

2 Histologia 1. Estudo dos tecidos vegetais ou animais Células + MEC + fluído intercelular TECIDO: Conjunto de células associadas e semelhantes que desempenham as mesmas funções básicas. Além das células que constituem os tecidos, estão presentes também as substâncias intercelulares e o liquido tecidual

3 Histologia 1. Estudo dos tecidos vegetais ou animais Células + MEC + fluído intercelular 2. Estudo da maneira como os tecidos se organizam para constituir os órgãos. Todos os órgãos são formados por uma combinação organizada de vários tecidos, permitindo seu perfeito funcionamento. 5 Histologia Nos animais vertebrados são quatro os tecidos encontrados: Epitelial de revestimento de secreção ou glandular Conjuntivo propriamente dito cartilaginoso ósseo hematopoiético adiposo 6 3

4 Características principais dos quatro tipos básicos de tecidos Tecido Célula Matriz extra celular Funções principais Epitelial Células poliédricas justapostas. Pequena quantidade. Revestimento da superfície ou de cavidades do corpo, secreção. Conjuntivo Vários tipos de células fixas e migratórias. Abundante Apoio e proteção. Muscular Células alongadas contráteis. Quantidade moderada. Movimento. Nervoso Longos prolongamentos. Nenhuma Transmissão de impulsos nervosos 7 Histologia Processo dependente de Microscópio tecidos e órgão espessos não permitem passagem de luz Submetidos a secções ou cortes delgados 8 4

5 MICROSCOPIA DE LUZ : 1. Coleta de amostras 2. Fixação 3. Desidratação 4. Diafanização 5. Impregnação 6. Inclusão 7. Microtomia 8. Montagem 9. Coloração Objetivo da técnica de preparação de tecidos é manter o aspecto tecidual o mais próximo possível de seu estado natural vivo Coleta: Partes de órgãos/tecidos são retiradas com o auxílio de bisturi e pinça biópsia ou necropsia; Não é indicada a extração de porções grandes, uma vez que o objetivo final é a obtenção de uma camada fina que possa ser analisada em um microscópio óptico. 10 5

6 2. Fixação: Procedimentos físicos ou químicos Imobilizar as substâncias constituintes das células e dos tecidos maior resistência para suportar as demais etapas. Retardar efeitos post mortem do tecido, mantendo sua arquitetura normal Impede a destruição das células por suas próprias enzimas (autólise), ou bactérias Fixação: Agentes fixadores mais utilizados: formol e líquido de Bouin (uma mistura de formol, ácido pícrico e ácido acético) Ambos fixam as proteínas evitando sua degradação. Congelamento O formol, por ser mais acessível e de uso simples, é o fixador mais utilizado nas técnicas histológicas. Contudo, seus resultados geralmente não são satisfatórios. Por essa razão é recomendada a dissolução de formol em tampão fosfatado. 12 6

7 2. Fixação: Tempo de fixação dependerá do tamanho do fragmento tecidual. É recomendado que o fragmento não ultrapasse 3 mm de espessura o volume de fixador seja no mínimo 20xs maior que o volume do fragmento. Após a fixação, a peça deve ser transferida para álcool 70%, por tempo indefinido Desidratação: Remoção da água tecidual e substituição por álcool; Série de banhos de álcool em concentrações crescentes, começando do 70% e subindo gradativamente até chegar ao 100%. 14 7

8 4. Diafanização ou clarificação: Substituição do etanol por uma substância intermediária frequentemente xilol A quantidade de xilol utilizada deve ser 10 a 20 vezes o volume da peça, e a duração da clarificação varia de acordo com as dimensões e a constituição do material, além da temperatura ambiente Impregnação: Os tecidos devem ser submetidos a banhos de parafina a 60 C, no interior de uma estufa; Em estado líquido, a parafina penetra nos tecidos, dandolhes, depois de solidificada, certa dureza; Possibilita os cortes finos. 16 8

9 6. Inclusão: Inclusão do fragmento tecidual em parafina fundida. Parafina penetra no tecido. Deixar endurecer. Obtém-se um bloco de parafina contendo o fragmento tecidual. Remove-se o excesso de parafina do bloco Microtomia: Corte do bloco contendo o fragmento tecidual em fatias muito finas (5 a 10 μm 1 μm = 0,001 mm) Micrótomo (Navalha de aço) 18 9

10 8. Montagem: Os cortes provenientes da microtomia são enrugados transferidos para o banho-maria a 58 C distendidos; Pescados com uma lâmina evita bolhas abaixo da fita; Levados à estufa a 37 C, por 10 minutos, para que se dê a colagem do corte à lâmina (lâminas podem ser revestidas previamente por uma fina camada de albumina para facilitar a adesão da peça); Montagem: São colocados em um suporte inclinado. São depositados em uma estufa a 60º para secagem entre uma e 24 horas

11 9. Coloração: Tem a finalidade de dar contraste aos componentes dos tecidos, tornando-os visíveis e destacados uns dos outros; Uso principalmente de corantes solúveis em água; A. Parafina deve ser removida desparafinização Coloração: B. Reidratação. C. Coloração. D. Desidratação. E. Fixação permanente da lamínula

12 Tipos de corantes: 1. Que diferenciam os componentes ácidos e básicos da célula. 2. Especializados, que diferenciam os componentes fibrosos da matriz extracelular. 3. Sais metálicos que precipitam nos tecidos formando depósitos de metal. 23 Corantes mais usados: Hematoxilina: Corante básico Componentes corados são denominados basófilos Cora componentes ácidos da célula com coloração azul/roxa Eosina: Corante ácido Componentes corados são denominados acidófilos Cora componentes básicos da célula com coloração rósea 24 12

13 Por exemplo, os núcleos das células, onde predominam substâncias ácidas (DNA), são basófilos, ou seja, coram-se pela hematoxilina (corante básico de cor roxa); por sua vez, o citoplasma, onde predominam substâncias básicas (proteínas estruturais), é acidófilo, corando-se pela eosina (corante ácido de cor rosa). Corte histológico corado por HE Hematoxilina-Eosina. 25 Outros corantes também são utilizados: Corantes ácidos: Eosina, orange G, fucsina; Coram proteínas citoplasmáticas, mitocôndrias, grânulos de secreção e colágeno; Corantes básicos: Hematoxilina, azul de metileno, azul de toluidina; Coram nucleoproteínas, ácidos nucléicos, glicoproteínas e glicosaminoglicanos; Coloração dupla: cora ao mesmo tempo estruturas acidas e básicas, mas em cores diferentes. Impregnação do corte por metais: Prata e Ouro Tec. Nervoso 26 13

14 Impregnação por prata Cérebro 40x 27 Lâminas de tecido ósseo Preparação por desgaste. Lâminas ósseas são confeccionadas de duas maneiras Desgaste Polimento com lixa Osso em crescimento, disco de cartilagem

15 Criomicrotomia: Microtomia de espécimes congelados. Nitrogênio líquido... Blocos de tecidos montados em um meio de congelamento rápido. Prontos para serem cortados a -20ºC com uma lamina de aço pré-resfriada. Aparelho: criostato. Cortes colocados em lamina de vidro pré-resfriada. Corados com corantes específicos. Preserva estruturas na sua forma original (enzimas e lipídeos). 29 Interpretação de cortes histológicos Observação Distorção dos tecidos Artefatos de técnica A retração dos tecidos por conta dos processos - espaços artificiais gera Espaços também são gerados pela á fixação ou moléculas retiradas por desidratação e clareamento. (Perda de Glicogênio e Lipídeos) Pregas do corte confunde com capilares Precipitados de corante ou sujeira 30 15

16 MICROSCOPIA DE LUZ histoquímica e citoquímica Localização de constituintes químicos específicos no tecido utilizando-se compostos químicos reagentes. 31 MICROSCOPIA DE LUZ imunocitoquímica Usa anticorpos com fluoresceína e anti-anticorpos para obter uma localização intra e extracelular mais precisa de macromolécula do que é possível com a citoquímica

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19 Bibliografia Gartner, L. e Hiatt, J. Tratado de Histologia. Elsevier, 2007 Junqueira e Carneiro. Histologia Básica. Guanabara Koogan Ross, M. e Pawlina, W. Histologia Texto e Atlas. Guanabara Koogan