Introdução à microscopia. Luis Lamber5 P. da Silva Departamento de Biologia Celular Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto- USP

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1 Introdução à microscopia Luis Lamber5 P. da Silva Departamento de Biologia Celular Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto- USP

2 Visualizando células - Microscopia Eduard Strasburger 1880 Célula vegetal em divisao Micrografias atuais do mesmo 5po celular Figure 1-4 Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

3 Componentes básicos de um micrópio óptico moderno Componentes ópticos Componentes mecânicos Ocular Braço Revólver Objetiva Base Charriot Parafuso Macrométrico Parafuso Macrométrico Controle iluminação Lente frontal da Objetiva Platina Condensador Diafragma-Iris do condensador Iluminador

4 Trajeto da luz no microscópio - Olho do observador ou detector - Lentes da Ocular - Lentes da Objetiva - Espécime - Lentes do condensador - Diafragma do condensador - Diafragma de campo -Iluminador

5 Funções dos Componentes ópticos Ocular: Amplia a imagem projetada pela objetiva e a projeta na retina. Objetiva: Coleta a luz que passa pelo espécime e projeta uma imagem aumentada deste em direção à Ocular. Condensador: Concentra a luz e projetam um feixe luminoso no espécime

6 Magnificação Magnificação total = Valor de Magnificação da objetiva X Valor de Magnificação da ocular

7 Poder de Resolução A menor distância entre duas partículas que permitam que elas sejam vistas como dois objetos separados O poder de resolução máximo ou limite de resolução do microscópio de luz é aproximadamente 0,2 µm Resolução = 0.61λ A.N. r = Resolução λ = comprimento de onda da luz usada (luz branca ~0,53um) A.N. = abertura numérica da objetiva

8 O poder de resolução de um microscopio óptico depende da objetiva Abertura numérica: A.N (capacidade de receber luz/informação do objeto) A.N. = n sen θ n = índice de refração do meio θ = ½ da abertura angular do cone de raios coletados pela objetiva a partir de um ponto tipico do especime)

9 Informações na armadura das objetivas

10 Olho nu Microscópio ó5co Microscópio eletrônico Figure 1-9 Essential Cell Biology ( Garland Science 2010)

11 Observação direta de células em microscopia de luz (informação sobre a morfologia e dinâmica de estruturas subcelulares é limitada) Microscopia ó5ca convencional Microscopia ó5ca contraste de fase

12 Azul: DNA Verde microtubulos Vermelho: centromeros

13 Aequorea victoria Osamu Shimomura

14 - Aequorin (Bioluminescente) Emite luz azul em resposta a Ca++ A energia de excitação e suprida por uma reação química. - GFP (fluorescente) Energia de uma fonte de luz é absorvida e re-emi5da como outro fóton de menor energia e comprimento de onda maior

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16 3 amino acids form the chromophore 66 O N N R R O H O H Serine, tyrosine, glycine (65-67) Protein 1 GFP GFP Protein 2 GFP Protein 3

17 Desenvolvimento e uso de GFP em biologia celular Premio Nobel 2008 Shimomura Chalfie Tsien

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19 HISTOLOGIA O avanço dos microscópios foi seguido pelo desenvolvimento de técnicas para a preparação de cortes delgados, para permitir a passagem da luz ou dos elétrons. Fixadores Meio de inclusão Micrótomos Corantes

20 HISTOLOGIA Técnicas histológicas A preparação de amostras para observação ao microscópio de luz transmitida, em geral, envolve as seguintes etapas: 1. Fixação 2. Inclusão (desidratação, diafanização, impregnação) 3. Microtomia (obteção de cortes muito finos) 4. Coloração 5. Montagem da lâmina

21 HISTOLOGIA Coloração A maioria dos corantes funcionam como ácidos ou bases Corantes básicos: carregam carga positiva e reagem com componentes celulares carregados negativamente: coram estruturas basófilas Ex. grupos fosfato, ácidos nucléicos, grupos sulfatos de glicosaminoglicanos e grupos carboxila das proteínas Ex de estruturas coradas: heterocromatina, RNA ribossômico, matriz extracelular da cartilagem Alguns corantes básicos: hematoxilina, azul de metileno, verde metil e azul de toluidina

22 HISTOLOGIA Coloração Corantes ácidos: carregam carga negativa e reagem com componentes das células carregados positivamente: coram estruturas acidófilas Ex de estruturas coradas: citoplasma, filamentos citoplasmáticos, fibras extracelulares Alguns corantes ácidos: eosina, fucsina ácida, azul de anilina e orange G

23 HISTOLOGIA Hematoxilina e eosina A combinação Hematoxilina e Eosina é a coloração mais usada em histologia e também em patologia para o diagnóstico de tumores Hematoxilina é um corante básico Cora estruturas com componentes ácidos como o núcleo HE do adrenal medula Eosina é um corante ácido Cora componentes básicos como o citoplasma

24 HISTOLOGIA Interpretação de cortes Distorções e artefatos causados pelo processamento dos tecidos - Aparecimento de espaços: Retração Perda de moléculas (lipídeos, glicogênio,...) - Dobras no corte - Precipitado de corantes Amostras bidimensionais de estruturas tridimensionais

25 Organelas da Célula eucarió5ca Célula Animal

26 O sistema de endomembranas RE, Complexo de Golgi, endossomos, lisossomos e membrana plasmá5ca compõem a via biossinté5ca

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28 Lâminas n o C02 e C02A Pâncreas - Ergastoplasma

29 celula centro-acinar Eletron-micrografia de uma celula acinar de pancreas de rato

30 Epidídimo impregnação por prata

31 Epidídimo impregnação por prata

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33 O Aparelho de Golgi consiste de uma serie ordenada de compartimentos

34 AP-1 Microscopia ó5ca de fluorescência Uso de an5corpos para visualizar organelas e/ou determinar localização de novas proteínas AP-4 TGN46

35 Aparelho de Golgi é visualizado em células vivas através do uso de uma proteína fluorescente

36 Disposição dos hepatócitos nos lóbulos hepá5cos Hepatócitos agrupados em placas interconectadas radialmente dispostas Espaços porta nos cantos dos lobulos

37 Veia centro-lobular

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39 Corte histológico de pâncreas de um rato injetado com o corante vital azul de tripan acúmulo em grânulos citoplasmáticos (fago-lisossomos)

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41 Túbulos uriníferos Néfron (corpúsculo renal, túbulo contorcido proximal, alça de Henle e o túbulo contorcido distal) Tubulo coletor Corpúsculo renal Capsula de Bowman Glomerulo

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