DESIDRATAÇÃO, DIAFANIZAÇÃO E CORTE

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1 DESIDRATAÇÃO, DIAFANIZAÇÃO E CORTE FIXAÇÃO DESIDRATAÇÃO CLARIFICAÇÃO INCLUSÃO & MONTAGEM TECIDO CORTE CONGELAMENTO 1

2 DESIDRATAÇÃO Remoção da água Soluções crescente de etanol Soluções de acetona, dioxano ÁLCOOL Etanol, álcool anidro Baixo custo Reaproveitamento das soluções Artefatos na peça histológica Encolhimento Precipitação de proteínas Colocado em soluções crescentes Rotina: 70%, 90% e 100% 3x Para peças delicadas: a partir de 50% 2

3 Lento Etanol 70% - 1 hora* Etanol 90% - 1 hora Etanol 100% - 1 hora Etanol 100% - 1 hora Etanol 100% - 1 hora Rápido Etanol 80% - 30 min Etanol 80% - 30 min Etanol 95% - 30 min Etanol 95% - 30 min Etanol 100% - 30 min Etanol 100% - 30 min ACETONA Rápido Inflamável Comercialização controlada Custo elevado - 1l $ H 2 O dest 5 min Acetona 30 min Acetona 30 min Benzol 30 min Benzol 30 min 3

4 DIOXANE 1,4 Para dionano Composto orgânico (éter) Relativamente seguro Se mistura diretamente a parafina Custo elevado 4l - $ partes dioxane \ 1 parte de H 2 O dest Dioxanepuro 1h Dioxane 2h CLARIFICAÇÃO / DIAFANIZAÇÃO Substituir a solução de álcool/similar por um meio miscível em parafina ou resina Também remove os pigmentos naturais das células 4

5 XILENO Mais utilizado Custo baixo Tóxico 1 hora 1 hora 45 minutos Tolueno Tolerante a água Tóxico Custo elevado Clorofórmio Extremamente tóxico Difusão demorada 5

6 DERIVADOS DE LIMOLENO Derivado de frutas cítricas Baixa toxicidade Agressivo a peças pouco fixadas ou desidratadas INFILTRAÇÃO/INCLUSÃO Transformar a peça em um meio duro para que se realize o corte no micrótomo Parafina/similares Resinas plásticas Celoidina 6

7 PARAFINA Usado em rotina Parafina de alto ponto de fusão (56-58 C) Tecidos mais consistentes Parafina de baixo ponto de fusão (48-56 C) Parafina misturada a outros materiais Paraplast 1 hora 1 hora 45 minutos 1 hora 7

8 CELOIDINA Solução concentrada de piroxilina purificada (nitrato de celulose). Tecidos delicados globo ocular Peças grandes fatias de cérebro Infiltração lenta em soluções gradativas Se a peça for muito grande, os cortes devem ser realizados em um micrótomo de deslizamento Tecido fixado e desidratado em álcool Blocos devem ser mantidos em álcool 50% Álcool 50% - depende do tamanho Álcool 70% - 1 dia Álcool 95% - 1 dia Álcool 100% - 1/2 dia Álcool 100% - 1/2 dia Álcool / Éter 1:1-1 dia Celoidina 4% - 2 a 3 dias Celoidina 8% - 2 a 3 dias 8

9 OUTRAS RESINAS PLÁSTICAS Para cortes mais finos (< 4µm) Reagentes mais caros Amostras pequenas Podem requerer o uso de um ultramicrótomo Metacrilado Glicol Metacrilado Araldite Epon CORTE O corte é efetuado em um instrumento chamado micrótomo Micrótomo para parfina Micrótomo de congelamento - criostato Micrótomo para celoidina Os cortes assim obtidos são dispostos em lâminas de vidro Prof. Sacha Braun 9

10 MICROTOMIA Todos os três possuem: - suporte para a peça emblocada (braço) - Suporte para a navalha - Sistema mecânico de movimentação MICRÓTOMO (MANUAL) Mais empregados Pequenas amostras (área) Espessuras de até 4 µm 10

11 MICRÓTOMO DE DESLIZAMENTO Grandes espécimes 155 x 90 mm 30 µm espessura 11

12 Prof. Sacha Braun 12

13 Micrótomo portátil ou por congelação MICROTOMIA Usa-se navalhas permanentes* ou descartáveis A Navalha deve estar extremante limpa e bem afiada Há controle de espessura Morfologia: cortes + finos Himunohistoq.: cortes + grossos 13

14 MICROTOMIA ÂNGULO DE FACETA Ângulo entre a navalha e o bloco Muito vertical: a navalha vibra e o corte fica com uma sucessão de bandas alternadas mais finas e mais espessas Ideal entre 5º e 10º, variando um pouco em função da dureza do bloco MICROTOMIA Em temperaturas ambiente superior a 25ºC, resfriar os blocos com cubo de gelo A velocidade do corte também é importante para bons resultados. Testar várias velocidades antes de obter os cortes definitivos. (tecidos mais moles, cortes lentos 14

15 MICROTOMIA Material Necessário: Micrótomo Banho-Maria de fundo preto até 45ºC Pinça curva Pincel Água Álcool 40%* Cubo de gelo* Lâminas limpas Suporte para lâminas MICROTOMIA MÉTODO DO CORTE Fixar bem o bloco no braço Ajustar a navalha (ângulo) Desbastar o bloco (até atingir o órgão e forma uniforme). Isto deve ser feito com espessura maior Regular a espessura desejada 15

16 Executar os cortes (formação de uma fita) Transferir a fita, com auxílio da pinça e pincel, para o banho-maria para distendê-los baixa temperatura o corte não distende; Alta temp. a parafina funde e o corte desfaz) Uma vez na superfície da água, os cortes devem ser distendidos com uma pinça de ponta curva de modo a desfazer as dobras (muito freqüentes) Separar individualmente (ou em grupos) com ajuda da pinça Pescar os cortes com a lâmina (mergulhar diagonalmente no banho próximo ao corte, esperar aderir ao vidro e retirar lentamente) 16

17 As lâminas podem ser colocadas na horizontal em uma estufa a 60ºC/3h para distender mais (opcional) Transferir para um suporte inclinado e colocar em estufa a 60º C por 12 a 24 horas Lâminas limpas: lavar em detergente, lavar bem em água e depois álcool Alguns evitam detergente pois requer lavagem excessiva Alternativo: Álcool 90%:ácido clorídrico (9:1) por tempo 2horas 17

18 Para evitar o desprendimento de cortes nas lâminas: Revestir a superfície da lâmina com uma delgada camada de proteína (albumina ou gelatina) ou dissolve-la no banho-maria (+ agente anti-microbiano) A adesão por proteínas não é inerte aos corantes, podem ocorrer manchas Adesão com vapores de formol (coloca as lâminas em cuba de coloração com 2 ou 3 ml de formol puro, sem que atinja os cortes e tampa-se. Vai para estufa 60º C por 1 h) PROBLEMAS NA MICROTOMIA 80% dos problemas são na realidade derivados das etapas de desidratação e inclusão Fitas de corte curvas ou irregulares A navalha e o bloco não estão paralelos Bloco irregular de paredes não paralelas borda de corte (fio) da navalha irregular parafina não homogênea ou impura Cortes comprimidos, irregulares ou pregueados Navalha mal afiada Navalha ou bloco quentes (resfriar) Ângulo da navalha pequeno demais Parafuso de prender o bloco solto 18

19 PROBLEMAS NA MICROTOMIA Fragmentação dos cortes ou cortes rasgados Inclusão imperfeita Parafina quente demais durante a inclusão ou emblocamento Arranhaduras nos cortes ou cortes divididos em segmentos Dente no fio da navalha Sujeira no bloco ou na navalha Ângulo da navalha muito grande Partículas duras no tecido ou parafina Peça excessivamente dura (por álcool ou xilol) PROBLEMAS NA MICROTOMIA Cortes grudam no bloco ao subir o braço do micrótomo Ângulo da navalha grande demais Fio da navalha sujo Navalha sem fio (também os cortes não saem em fita) Cortes aparecem alternadamente finos e grossos Blocos grandes demais Parafusos soltos Ângulo da navalha pequeno demais Temperatura ambiente elevada 19

20 DESMINERALIZAÇÃO CONCEITO DE DESMINERALIZAÇÃO Desmineralização é o ato de retirar, por meio de agentes químicos, sais minerais de tecidos, com o objetivo de permitir que estes sejam cortados e preparados. Remoção dos sais de cálcio que se encontram depositados nos tecidos orgânicos, a fim de permitir o corte e processamento anterior destes. 20

21 O DESCALCIFICADOR IDEAL Inerte Não interferir nas estruturas remanescentes Transparente Não deve agredir as estruturas moles Bactericida Rápido efeito descalcificador Formar o mínimo possível de precipitado Não interferir em coloração posterior A ESCOLHA DO DESCALCIFICADOR Urgência do caso Grau de mineralização Foco da pesquisa Técnica de coloração a ser utilizada Preço Disponibilidade 21

22 CONSIDERAÇÕES PARA A ESCOLHA Em geral, quanto mais rápida a ação do desmineralizante, mais danos são causados à estrutura Alguns agentes dificultam colorações especiais, A maior diferença entre os agentes é o tempo de ação Aceleram o processo Temperatura agitação QUELANTES MAIS UTILIZADOS Solução de EDTA (Ácido Etileno Diamino Tetracético) Ácido fórmico Ácido fórmico-citrato de sódio Ácido nítrico Ácido clorídrico 22

23 SOLUÇÃO DE EDTA Formas de apresentação Gel Pó Líquido Mais usado em histologia Imagens: SOLUÇÃO DE EDTA Boa preservação dos tecidos moles Compatibilidade com os métodos de coloração mais utilizados PH neutro por semanas Melhor conservação dos tecidos Lento Preço acessível Mais utilizado para dentes 23

24 SOLUÇÃO DE EDTA Aguardar de 4 a 15 dias Verificações diárias Considerar trocas de solução quando houver precipitado Estágio ideal Peça flexível Som surdo ao ser jogada (levemente) contra metal Aspecto borrachóide ÁCIDO FÓRMICO-CITRATO DE SÓDIO Ação mais eficaz (2 a 8 dias) Maior velocidade Melhor efeitos sobre peças pequenas Peças grandes demandam maior tempo de ação do ácido e são mais suscetíveis à danos Maior liberação de íons hidrogênio na região do precipitado (trocar solução diariamente) Manter a peça suspensa na solução 24

25 ÁCIDO FÓRMICO-CITRATO DE SÓDIO Aspecto final semelhante ao obtido com EDTA Flexível e aspecto borrachóide Lavar em água corrente por 4 a 8 horas Evitar danos teciduais Melhor coloração Melhor conservação da peça Calvão, Luis Felipe da Rocha, AVALIAÇÃO DO GRAU DE DESCALCIFICAÇÃO DENTÁRIA PRODUZIDO POR DIFERENTES ÁCIDOS PROPOSTOS PARA DIAFANIZAÇÃORevista Odonto Ciência Fac. Odonto/PUCRS, v. 22, n. 57, jul./set ÁCIDO FÓRMICO + ÁLCOOL Para fragmentos pequenos 5 ml de ácido fórmico + 95 ml de álcool 95% ou 85% Manter por 24 a 48 horas Lavar em água corrente por 10 minutos Desidratar em álcool 70%, 80%, 90%, 95% e 100% Xilol e parafina 25

26 ÁCIDO NÍTRICO Ácido forte, corrosivo Alta volatividade Relativa flamabilidade Muito utilizado em laboratórios de análises clínicas É um dos mais rápidos Melhor quando se exige rápido diagnóstico ÁCIDO NÍTRICO Elevada acidez Não deve ser mantido por longo tempo Maior dano tecidual Preço acessível Facilidade para preparar a solução 26

27 ÁCIDO NÍTRICO Ácido nítrico 7% Sempre colocar o ácido na água Tempo varia de acordo com a peça 1 a 3 dias Exemplo: 3 dias para peça de 1 cm X 1 cm ÁCIDO NÍTRICO Verificar condições da peça Textura Flexibilidade Lavar em água corrente por pelo menos 3 horas Banhos sucessivos de álcool Xilol e parafina 27

28 ÁCIDO CLORÍDRICO Ácido forte Ioniza totalmente em água Forma mais utilizada Ácido clorídrico de 2 % a 5% Maior dano tecidual Boa manutenção da cor do tecido Preço acessível Armazenamento e manuseio delicados CONSIDERAÇÕES FINAIS Na prática, o principal fator para escolha do agente descalcificador é sua viabilidade para ser adquirido e sua eficácia sobre a peça a ser processada 28