BIOLOGIA CELULAR. Msc. Jessica Borges de Oliveira

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1 BIOLOGIA CELULAR Msc. Jessica Borges de Oliveira

2 Métodos de estudo da célula: microscopia, técnicas de preparo de lâminas, métodos moleculares Microscopias ópticas Microscopias eletrônicas Estudos das células vivas Análises moleculares do DNA

3 Introdução Macroscópicas Microscópicas

4 Introdução As unidades de medida utilizadas: micrômetro (µm), para a microscopia óptica; nanômetro (nm) e o angstrom (Å), para a microscopia eletrônica.

5 5 Introdução MICRÔMETRO (µm) 1mm = μm NANÔMERO (nm) 1μm = nm ÂNGSTROM (Å) 1nm = 10 Å ESTA UNIDADE ESTÁ SENDO SUBSTITUÍDA PELO NANÔMETRO PRINCIPAIS UNIDADES DE MEDIDAS USADAS NA MICROSCOPIA

6 Introdução Poder de ampliação: capacidade de um aparelho aumentar uma imagem. Na microscopia é dado pelo produto entre a ampliação das oculares e a ampliação das objetivas. Poder de resolução: capacidade de um aparelho fornecer imagens distintas de dois pontos distintos. Limite de resolução: distância mínima a que dois pontos podem estar para o aparelho os mostrar individualizados.

7 Introdução

8 Introdução ESPOROS DE LEVEDURAS HEMÁCIAS CÉLULAS TUBULARES DO EPITÉLIO RENAL EXEMPLO DE LIMITE DE RESOLUÇÃO: É A MENOR DISTÂNCIA QUE DEVE EXISTIR ENTRE DOIS PONTOS PARA QUE ELES APAREÇAM INDIVIDUALIZADOS. O que determina, a riqueza de detalhes da imagem fornecida por um sistema óptico é o seu limite de resolução, e não o seu poder de aumentar o tamanho do objeto.

9 Introdução Óptico Campo luminoso Campo escuro Ultravioleta Fluorescente Contraste de fase Transmissão Varredura Eletrônica Transmissão Varredura

10 Técnicas usadas em citologia Introdução Citoquímicas Imunocitoquímicas Radiofotografia

11 Microscopias ópticas Serve para ampliar um objeto. Funciona com um conjunto de lentes que ampliam a imagem. A iluminação é natural ou artificial. É constituído por uma parte mecânica que suporta e permite controlar uma parte óptica que amplia as imagens.

12 Microscopias ópticas

13 OCULARES BRAÇO OU SUPORTE OBJETIVAS PLATINA REVÓLVER CONDENSADOR PARAFUSO MACROMÉTRICO LÂMPADA PARAFUSO MICROMÉTRICO BASE

14 Microscopias ópticas Oculares

15 Microscopias ópticas Canhão ou tubo

16 Microscopias ópticas Braço

17 Microscopias ópticas Revólver

18 Microscopias ópticas Objetivas

19 Microscopias ópticas Platina

20 Microscopias ópticas Condensador

21 Microscopias ópticas Diafragma

22 Microscopias ópticas Fonte de Luz

23 Microscopias ópticas Parafusos Macro e Micrométricos

24 Microscopias ópticas Base ou pé

25 Microscopias ópticas BACTÉRIAS CÉLULA LEUCÓCITOS CÉLULAS SANGUÍNEAS Aparelho com lentes ópticas que maximiza um ser ou estruturas minúsculas a um tamanho de boa observação

26 Microscopias ópticas Condensador Sua finalidade é projetar um cone de luz sobre as células que estão sendo examinadas ao microscópio. Após atravessar as células, esse feixe luminoso, em forma de cone, penetra nas objetivas. Objetivas Projetam uma imagem aumentada, no plano focal das oculares, que novamente a amplia. Oculares As imagens fornecidas pela oculares podem ser percebidas pela retina.

27 Microscopias ópticas OBJETIVAS (COM OCULAR DE 10X) AMPLIAÇÃO TOTAL (VER SEMPRE AS OCULARES) 04 x 40 X 10 x 100 X 40 x 400 X 100 x (Sempre usar com óleo de Imersão) 1000 X

28 Microscopias ópticas Microscópio Monocular

29 Microscopias ópticas Microscópio Multifuncional

30 Microscopias ópticas Microscópio Operação

31 Microscopias ópticas Microscópio Binocular Biológico

32 Microscopias ópticas A microscopia óptica continua sendo e será ainda por um longo tempo uma técnica bastante utilizada na indústria de microeletrônica. Os microscópios tradicionais possuem como vantagens a sua disponibilidade, custo relativamente baixo se comparados aos equipamentos de outras técnicas, proporciona uma medida não destrutiva da amostra e é possível se analisar toda a lâmina. A desvantagem está na sua resolução e precisão limitadas pelos sistemas ópticos tradicionais. Contudo, ainda é o meio mais prático para medidas qualitativas.

33 DIFERENÇAS DE IMAGENS ENTRE UM MICROSCÓPIO ÓPTICO (MO) E UM MICROSCÓPIO ELETRÔNICO (ME) HEMÁCIAS LEUCÓCITO PLAQUETAS MICROSCOPIA ELETRÔNICA (ME) DE BACTÉRIAS COMENSAIS EOSINÓFILOS LINFÓCITO MICROSCOPIA ÓPTICA EM LÂMINA DE TECIDO SANGUÍNEO

34 Microscopias eletrônicas Microscópio Eletrônico de Transmissão MET Microscópio Eletrônico de Varredura - MEV

35 Microscopias eletrônicas

36 Microscopias eletrônicas Organelas celulares

37 Microscopias eletrônicas Cultura de células

38 Microscopias eletrônicas Espinha de ouriço Superfície foliar de Corymbia citriodora

39 Microscopias eletrônicas Espermatozóide de Hamster

40 Microscopias eletrônicas Pata de lagarta

41 Microscopias eletrônicas Antena de Lepidoptera

42 Microscopias eletrônicas Esporo de fungo

43 Tipo de microscópio que se utilizou na observação dessas imagens?

44 Estudos das células vivas Como visualizar células e diferentes estruturas celulares???

45 Estudos das células vivas

46 Estudos das células vivas Microscópio óptico Séc. XIX e XX: avanço do microscópio óptico, de luz ou fotônico (do grego photos, luz); Fornece aumento do objeto em até 1000x.

47 Estudos das células vivas

48 Estudos das células vivas Microscópio eletrônico A partir da década de 50; Fornece aumento do objeto de a x. Microscópio eletrônico de transmissão Para cortes ultrafinos, corados com metais pesados contraste (imagem preto e branco). Microscópio eletrônico de varredura Para espécimes espessos ou células inteiras que tenham sido previamente fixadas (imagem em 3D).

49 Estudos das células vivas

50 Estudos das células vivas Técnicas para observação de células ao microscópio óptico Observação vital Esfregaço Esmagamento Preparação histológica

51 Estudos das células vivas Observação vital Material biológico vivo é colocado entre a lâmina e lamínula; Ex: células vegetais vivas.

52 Esfregaço Estudos das células vivas Material biológico constituído por células isoladas ou pouco unidas entre si: espalhamento sobre a lâmina; Ex: sangue.

53 Esfregaço Estudos das células vivas

54 Esfregaço Estudos das células vivas

55 Esfregaço Estudos das células vivas

56 Esfregaço Estudos das células vivas

57 Esfregaço Estudos das células vivas

58 Esfregaço Estudos das células vivas

59 Esfregaço Estudos das células vivas

60 Esfregaço Estudos das células vivas

61 Esfregaço Estudos das células vivas

62 Esfregaço Estudos das células vivas

63 Esmagamento Estudos das células vivas

64 Esmagamento Estudos das células vivas

65 Esmagamento Estudos das células vivas

66 Esmagamento Estudos das células vivas

67 Esmagamento Estudos das células vivas

68 Estudos das células vivas Preparação histológica Fixação, inclusão em parafina, corte em micrótomo, coloração e montagem da lâmina histológica permanente; Ex: tecidos animais. Vilosidades intestinais Pele

69 Análises moleculares do DNA Os avanços permitiram conhecer, sequenciar e até alterar o código genético de um ser vivo. Essas informações têm sido aplicadas em muitas situações que envolvem a nossa vida, tais como: serviços de aconselhamento genético, prevenção de doenças hereditárias e diagnóstico pré-natal sobre anomalias genéticas em fetos; identificação de pessoas com base na análise de DNA; testes de paternidade; produção de medicamentos.

70 Análises moleculares do DNA A tecnologia de manipulação do DNA tem melhorado a qualidade de vida das pessoas com diabetes. A técnica do DNA recombinante permitiu que bactérias transgênicas produzissem uma insulina idêntica a do pâncreas humano, evitando assim complicações por alergia. Compare as vantagens da insulina produzida com base na técnica da clonagem molecular com a insulina produzida por outras fontes. Para isso, pesquise e se atualize.

71 Análises moleculares do DNA Dependendo do objetivo, além de bactérias, outros organismos também são utilizados para clonar segmentos de DNA. Observe: Os vírus bacteriófagos são utilizados como vetores e podem clonar fragmentos maiores de DNA; Outra maneira de obter clones de segmento de DNA é a utilização da levedura Sacchamyces cerevisae, que recebe um segmento de DNA plasmidial e, ao ser reproduzido, transmite as células filhas às substâncias que se quer produzir.

72 Análises moleculares do DNA Outro método que tem numerosas aplicações é a eletroforese. Consiste na separação de substâncias (DNA, RNA ou proteínas) utilizando um campo elétrico. Veja o procedimento da separação em gel do DNA: 1- Submetem-se fragmentos de DNA em uma placa contendo gel de algarose (carboidrato extraído da parede celular de algas) que recebe uma corrente elétrica; 2- Os fragmentos de DNA percorrem o gel e se deslocam em direção ao polo elétrico positivo (os menores se movimentam mais rapidamente que os maiores). 3- Quando a corrente elétrica é desligada, os fragmentos param em posições diversas em forma de bandas ou faixas. 4- Aplica-se brometo de etídio (C 21 H 2 OBrN 3 ) corante que adere ao DNA que, quando iluminado com raios ultravioletas, fluoresce e possibilita a visualização das bandas de DNA.

73 Análises moleculares do DNA O resultado da eletroforese é uma imagem fotográfica semelhante a um código de barras ou impressão digital : é o DNA fingerprint. Observe a imagem! Equipamento para eletroforese em gel Filme de bandas de DNA Imagem: Mnolf / GNU Free Documentation License. Imagem: Jeffrey M. Vinocur / GNU Free Documentation License.

74 Análises moleculares do DNA Hibridação molecular e detecção de pessoas pelo DNA Nos seres eucarióticos, o corte do DNA por uma endonuclease de restrição produz uma quantidade muito grande de fragmentos, impossível de se visualizar na separação eletroforética. Para que a visualização aconteça, usa-se a técnica da hibridação molecular; dessa forma, apenas determinadas bandas de DNA são evidenciadas. A hibridação molecular é uma técnica empregada na identificação de pessoas e consiste em tratar o gel de modo a separar as cadeias duplas dos fragmentos de DNA e de sequências específicas especiais, as chamadas sondas de DNA. Dessa forma, apenas determinadas bandas são marcadas e podem ser analisadas.

75 Análises moleculares do DNA No caso da identificação de pessoas, as sequências de DNA usadas para detectar o DNA fringerprint são chamadas VNTR (Variable Number of Tandem Repeats), isto é, número variável de repetições em sequências, e são formadas por repetições de poucos nucleotídeos. Com exceção dos gêmeos univitelínicos, cada pessoa tem um padrão específico de repetições herdados dos pais. As amostras dos envolvidos são tratadas com endonucleases de restrição; Depois, são colocadas em uma mesma placa de gel e tratadas com uma sonda que revela certos tipos de VNTR; O resultado é um padrão de faixas mostrado como um filme. As sequências de DNA utilizadas para identificar pessoas

76 Análises moleculares do DNA Aplicações práticas de DNA fingerprint A popularidade do DNA se deve, entre outros fatores, aos testes de paternidade propagados pela mídia. Descubra quem é o pai da criança! Mãe Criança Homem A Homem B Teste de paternidade: compare os códigos de barra da mãe e da criança com o código de barra dos dois prováveis pais. A criança deve ter 50% do padrão de barras da mãe e 50% do padrão de barras do pai. Fonte:

77 Análises moleculares do DNA Mãe Criança Homem A Homem B Os testes que utilizam DNA fingerprint são tão seguros que fornecem 99,9% de certeza. Se você respondeu homem B, parabéns! Observe que as três bandas de DNA de origem paterna (não encontradas na mãe) ocorrem no homem B. Para realizar o exame de DNA, basta ter qualquer amostra biológica, como pele, cabelo, sangue, sêmen, entre outras. Teste de paternidade. Identificação de pessoas em investigações policiais ou judiciais. Aconselhamento genético.

78 Análises moleculares do DNA Que são organismos transgênicos? Plantas Transgênicas Os Organismos Geneticamente Modificados (OGM), ou transgênicos, são aqueles que recebem genes de outras espécies. Curiosidade: os cientistas conseguiram introduzir, na planta do tabaco, um gene de vagalume capaz de sintetizar a enzima luciferase que catalisa, nesse inseto, a degradação da luciferina (proteína que produz luz). O gene clonado em plasmídeo multiplicouse em bactérias e, depois de purificado, foi injetado na célula de fumo. O gene modificado passou para o DNA da planta, que, quando regada com luciferina, emitia luz como o vagalume.

79 Análises moleculares do DNA O peixe-zebra também conhecido popularmente como paulistinha ou bandeirinha foi o primeiro animal geneticamente modificado a ser vendido em grande escala. Observe o detalhe das características do peixe antes e depois da transgenia. Peixe-zebra: primeiro animal geneticamente modificado para fins comerciais. Peixe Glofish: resultado do peixe-zebra geneticamente modificado.

80 OPERAÇÃO (PRÁTICA LABORATORIAL) NORMAS E CONDUTAS NA PRÁTICA LABORATORIAL 1. OBEDECER TODAS AS NORMAS DE BIOSEGURANÇA (EPI/EPC). 2. LAVAR AS MÃOS NA ENTRADA E NA SAÍDA APÓS A PRATICA. 3. É OBRIGATÓRIO QUE VOCÊ CONHEÇA AS PARTES ÓPTICAS E MECÂNICAS DOS MICROSCÓPICOS ANTES DE USÁ-LO. 4. NÃO MANUSEAR O APARELHO COM AS MÃOS SUJAS OU MOLHADAS 5. NUNCA DESLOQUE O APARELHO COM A LÂMPADA ACESA. 6. NA REMOÇÃO DO EQUIPAMENTO, SEGURE-O FIRMEMENTE COM UMA DAS MÃOS NO BRAÇO E A OUTRA NA BASE. 7. É PROIBIDO O USO DE CÂMARAS FOTOGRÁFICAS DURANTE A EXPOSIÇÃO DA AULA PRÁTICA.

81 COMO USAR O MICROSCÓPIO 1. INICIE SEMPRE PELA OBJETIVA DE MENOR AUMENTO. 2. NA OBSERVAÇÃO DE UMA PREPARAÇÃO, OLHE PELA OCULAR E MOVA O MACROMÉTRICO MUITO LENTAMENTE, ASSIM QUE A IMAGEM APARECER, MESMO CONFUSA, PARE E COMPLETE A FOCALIZAÇÃO COM O MICROMÉTRICO. USANDO A OBJETIVA 100x O USO DA OBJETIVA DE IMERSÃO É MAIS DELICADA POIS, A DISTÂNCIA FOCAL ENTRE A FACE DA OBJETIVA E A PARTE SUPERIOR DA LAMÍNULA, DIMINUI QUANDO A AMPLIAÇÃO É AUMENTADA.

82 COLORAÇÃO QUASE TODAS AS ORGANELAS SÃO TRANSPARENTES E INCOLORES, O QUE DIFICULTA SEU ESTUDO MICROSCÓPICO, LOGO A COLORAÇÃO FACILITA A VISUALIZAÇÃO DAS ESTRUTURAS DOS TECIDOS. PARA VENCER ESSA DIFICULDADE, FORAM CRIADOS NUMEROSOS PROCESSOS DE COLORAÇÃO QUE TORNAM VISÍVEIS OS DIVERSOS COMPONENTES CELULARES.

83 A MAIORIA DOS CORANTES COMPORTA-SE COMO ÁCIDOS OU BASES ESTRUTURAS BASOFÍLICAS: SÃO OS COMPONENTES DOS TECIDOS QUE SE CORAM FACILMENTE COM CORANTES BÁSICOS (Hematoxilina) EX: ESTRUTURAS ÁCIDAS (NÚCLEOS) ESTRUTURAS ACIDÓFILAS: SÃO OS COMPONENTES DOS TECIDOS QUE SE CORAM FACILMENTE COM CORANTES ÁCIDOS (Ex:EOSINA) EX: ESTRUTURAS BÁSICAS (ORGANELAS CITOPLASMÁTICAS)

84 TÉCNICAS DE COLORAÇÃO MAIS USUAIS, TÉCNICA DE IMPREGNAÇÃO PELA PRATA E ALGUNS DOS RESULTADOS OBTIDOS COM ELAS: TÉCNICAS CONSTITUINTES NÚCLEOS CITOPLASMA FIBRAS COLÁGENAS FIBRAS RETICULARES HE HEMALÚMEN (Hematoxilina), EOSINA HEMATOXILINA FÉRRICA AZUL PRETO ROSA ROSA TRICRÔMICO DE MASSON FUCCINA ÁCIDA E PONCEAU DE XILIDINA, VERDE-LUZ VERMELHO VERDE IMPREGNAÇÃO ARGÊNTICA PARA FIBRAS RETICULARES SOLUÇÕES DE SAIS DE PRATA PRETO

85 OS MICROSCÓPIOS MODERNOS UTILIZAM LASERS COMPLEXOS, DETECTORES EXTREMAMENTE SENSÍVEIS, OBJETIVAS PODEROSAS. PERMITEM FILMAR DIVISÃO CELULAR, O TRÁFICO DE MOLÉCULAS DENTRO DAS CÉLULAS, PERMITEM OBSERVAR CERTAS PROTEÍNAS NO CÉREBRO DE ANIMAIS VIVOS ETC.

86 EXERCÍCIOS DE FIXAÇÃO 1.Defina microscópio, suas principais estruturas ópticas e mecânicas, observando os cuidados a serem utilizados no manuseio deste aparelho. 2.Diferencie Poder de Resolução de Limite de Resolução. 3.Quais os cuidados a serem observados antes de manusear o aparelho? 4.Defina Ampliação Total. 5.Cite 6 elementos estruturais de um Microscópio Óptico. 6.Quais os dois principais corantes da Técnica de coloração por HE? 7.Quais os cuidados individuais que se deve ter ao uso dos laboratórios? 8.Defina Equipamento de Proteção Individual (EPI). 9.Qual a importância dos Equipamento de Proteção Coletiva (EPC)? 10.Cite 5 condutas inapropriadas dentro de um laboratório. 11. Qual a única objetiva que só deve ser usada com óleo de imersão?

87 DÚVIDAS???

88 Morfologia da célula de procariotos e eucariotos. Células Procarióticas Células Eucarióticas

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