Vírus da Peste suína Clássica - VPSC. Diagnóstico Laboratorial

Transcrição

1 Vírus da Peste suína Clássica - VPSC Diagnóstico Laboratorial Freitas, T. R. P. 2009

2 Diagnóstico laboratorial Variabilidade dos sinais clínicos e das lesões post- mortem

3 Doenças confundíveis Exame diferencial Síndrome da Dermatite e Nefropatia suína - PDNS Síndrome Multissistêmica do Definhamento de suínos - SMDS Salmonelosis Erisipelas Pasteurelosis Actinobacilosis Hemófilos: Haemophilus parasuis

4 Diagnóstico laboratorial Métodos e Técnicas aplicadas

5 Pesquisa do vírus e anticorpos Animais vivos: Detecção do vírus. Antígenos virais ou ácido nucléico viral em sangue total e anticorpos no soro Animais mortos Detecção do vírus, antígenos virais ou ácido nucléico

6 Identificação do Vírus Imunofluorescência direta sobre cortes Elisa de Captura Reação em cadeia de polimerase - PCR Isolamento viral em cultivo celular Freitas, T.R.P., 2001: Vírus da peste suína clássica. Contrastação negativa - MET X.

7 Imunofluorescência direta sobre cortes congelados - criostato Anticorpos monoclonais (Mabs) Determinar se fluorescência é causada por VPSC ou outros pestivirus Específicos para cepas de campo Específicos para cepas vacinais

8 Elisa Captura de antígenos Elisa duplo sanduíche Monoclonais ou Policlonais Aplicadas em sangue total (anticoagulante) Técnica relativamente simples (Kits) Desvantagem: Menos sensível Não aplicável em animal isolado

9 Demonstração de ácido nucléico viral Reação da cadeia de polimerase PCR Retro transcriptase-pcr: RT- PCR Real time PCR Vários protocolos Sensibilidade e rapidez Desvantagem: resultados falso- positivo, falso negativos deve ser confirmado pelo isolamento Vigilância dos primes

10 Isolamento em cultivo celular Método mais sensível Macerado de tecidos alvo Células de linhagem de rim de suíno As culturas são examinadas para avaliação da replicação viral (24, 48, 72h) Imunofluorescência indireta (IFI) ou imunoperoxidase (PLA) Soro policlonal anti VPSC ou monoclonais Conjugado anti-espécie

11 Amostras de tecido Amídalas (Tonsilas) - Linfonodos (faríngeo, mesentérios) - Baço - Porção distal do ileum - Rins Remessa refrigerada Enviada o mais rápido possível ao laboratório.

12 Processamento do tecido Suspensão viral > 1-2 gramas de tecido Macerado Suspensão (20%) em meio Tratamento com antibiótico Repouso Centrifugação (1000g 15 ) Inoculação em células

13 Célula Cultivo de células de linhagem PK15 porcine kidney cell - 15 (ATCC/US) Tubos de Leigton (IFI) ou em microplacas para cultivo 24h após semeadura confluência superior a 80% Ou usar células em divisão

14 Isolamento do vírus Suspensão viral Amostras de tecido para teste macerado em meio de cultura ou tampão fosfato estéril e tratado com antibióticos Inoculação direta sobre a monocamada de células confluente Adsorção: 1 a 1,5 h em estufa CO2, atmosfera úmida, temperatura de 37ºC.

15 Revelação IFI As lamínulas devem ser colhidas em 24, 48 e 72 horas. Fixadas em acetona Processadas para leitura (IFI) anticorpo anti-psc (primário) anticorpo anti-espécie (secundário) conjugados com fluoresceína

16 Revelação PLA As monocamadas são fixadas frio (-80) acetona fria pura Secas pelo calor. Processadas para leitura anticorpo anti-vpsc (primário) anticorpo anti-espécie (secundário) conjugados com fluoresceína

17 Identificação do Vírus da Peste Suína Clássica utilizando anticorpos monoclonais Células PK15 infectadas com o VPSC. Infecção citoplasmática revelada pela técnica IFI utilizando anticorpos monoclonais (Freitas, 2001).

18 IFI: 24 horas Pequeno foco VPSC 24 horas Controle celular não infectado

19 Diagnóstico do VPSC: IFI Células PK15 infectadas com o VPSC. Infecção citoplasmática revelada pela técnica IFI, 72 horas pós infecção celular. Aumentos:20x e 40x.(Freitas, 2001).

20 Diagnóstico do VPSC: IP ou PLA Células PK15 infectadas com o VPSC. Infecção citoplasmática revelada pela técnica Imunoperoxidase (IP), 48 horas pós infecção celular. Aumentos:20x e 20x.(Freitas, 2001).

21 Pesquisa de anticorpos Sorologia Elisa, NIFI, NPLA

22 Testes sorológicos Aplicação: demonstração anticorpos vírus específicos em: Rebanhos suspeitos Monitoramento Estudos de prevalência Exigências internacionais

23 Amostras e Testes confirmatórios Amostras de sangue sem anticoagulantes animais convalescentes ou de animais rebanhos que tiveram contato) Testes de neutralização NIFI NPLA Permite a diferenciação de anticorpos contra outros pestivírus

24 Pesquisa de anticorpos Neutralização da Peroxidase Neutralisation peroxidase-linked assay NPLA Neutralização da Imunofluorescência Fluorescent antibody virus neutralisation NIFI ELISA Enzymatic-linked immunosorbent assay

25 NIFI e NPLA Amostras de soro inativadas pelo calor (56 o ) Neutralização: mistura da suspensão viral conhecida com soro em teste (titulação) Inocular sobre monocamada de PK15 (tubos de Leighton ou microplacas). Revelar como citado para IFI e PLA Resultado: soro positivo neutraliza o vírus e impede a ocorrência dos focos virais soro negativo: ocorrência de focos virais

26 NPLA Soro Positivo: neutralização do VPSC- sem focos virais Soro negativo: presença de focos

27 ELISA Técnica imunológica baseada na formação do complexo antígeno-anticorpo. Após a reação antígeno-anticorpo, Conjugado com uma enzima (peroxidase) Substrato da enzima (Cromógeno) Aplicação: demonstrar ou quantificar anticorpos no soro. vários sistemas: PSC- Elisa de competição

28 Elisa de Competição: Detecção de anticorpos contra o VPSC aplicando ELISA de competição com monoclonais.

29 Concentração e Purificação do vírus Concentração de uma suspensão viral pode ser obtida através de várias técnicas sendo as mais comuns: a centrifugação e a diálise. A purificação, obtenção de partículas virais com um mínimo de resíduo. centrifugações em gradientes separação das amostras virais pela densidade. Gradientes: sacarose ou cloreto de césio.

30 Vírus da Peste Suína Clássica Purificação em gradiente de sacarose e visualização pela microscopia eletrônica (Freitas, T.R.P. 2001)

31 Referências: OIE Terrestrial Manual 2008 Freitas, T.R.P Estudos epidemiológicos, sorológicos e moleculares do vírus da peste suína clássica. Rio de Janeiro. Tese. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Freitas, T. R. P Conceitos Básicos, Métodos e Técnicas em Laboratório de Virologia Animal. 1ª Ed Pedro Leopoldo, MG.