11 a 14 de dezembro de 2012 Campus de Palmas

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1 SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DA IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA UTILIZANDO CEPA DE LEISHMANIA SPP. ISOLADA DE CÃO DA CIDADE DE ARAGUAÍNA-TO NO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE VISCERAL CANINA. Emerson Danillo da Silva Georgetti 1 ; Helcileia Dias Santos 2 1 Aluno do Curso de Medicina Veterinária; Campus de Araguaína; emersongeorgetti@hotmail.com PIBIC/UFT. 2 Orientadora do Curso de Medicina veterinária; Campus de Araguaína; helcileiadiassantos@hotmail.com. RESUMO Este estudo teve o objetivo de determinar a sensibilidade e especificidade da reação de imunofluorescência indireta (RIFI), utilizando cepa de Leishmania spp isolada de cão da cidade de Araguaína-TO, no diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina. Foram analisadas 80 amostras de soro, obtidas de cães de Araguaína. A RIFI foi realizada utilizando antígenos preparados a partir de formas promastigotas obtidas em cultivo de Leishmania spp isolada de cão de Araguaína e, para comparação, realizou-se a RIFI com antígenos provenientes de uma cepa padrão. Como teste ouro foi realizado a reação em cadeia de polimerase (PCR). A sensibilidade calculada para a RIFI utilizando cepa de antígenos de Araguaína foi de 76,2% e a especificidade de 52,9%, enquanto utilizando a cepa de Jaboticabal a sensibilidade foi de 65,1% e a especificidade foi de 64,7%. Os resultados obtidos apontam que utilizando-se como antígeno promastigotas de Leishmania da região de Araguaína, obtêm-se resultados próximos aos observados utilizando uma cepa já padronizada, portanto a origem geográfica do antígeno provavelmente não interfere no resultado da RIFI. Devido a baixa sensibilidade e especificidade observada recomenda-se a combinação com outra técnica para tornar o resultado mais confiável. PALAVRAS CHAVE: Leishmanioses; Método diagnóstico; Valor preditivo.

2 INTRODUÇÃO A Leishmaniose Visceral (LV) é uma enfermidade de grande impacto na saúde pública, presente em 88 países. É uma doença grave, que quando não tratada, pode apresentar letalidade de 95% e entre as doenças parasitárias é a segunda em número de óbitos (ALVAR, 2006). Nas Américas, o Brasil representa o país de maior endemicidade da LV que está distribuída nas cinco regiões brasileiras, sendo de caráter epidêmico em várias cidades. Sua expansão no país é um fato que vem desafiando os pesquisadores e profissionais da área da saúde (BRASIL, 2009; MICHALSKY et al., 2007). O protozoário responsável pela doença nas Américas é a Leishmania (Leishmania) infantum chagasi, que encontra-se sob duas formas principais no seu ciclo de vida: amastigotas e promastigotas. As amastigotas são encontradas no interior das células do sistema fagocítico mononuclear e as promastigotas são encontradas naturalmente no tubo digestivo das fêmeas dos vetores flebotomíneos (Diptera: Psychodidae), podendo ser cultivadas em laboratório em meios artificiais de cultura, sendo estas as formas infectantes para os hospedeiros vertebrados (LAINSON;RANGEL, 2005). O cão é apontado como o principal reservatório doméstico da LV, por coabitar com as pessoas e, muitas vezes, apresentar infecção pelo parasito sem ter um quadro clínico aparente (MICHALSKY et al., 2007). O teste de imunofluorescência indireta é utilizado para detectar anticorpos contra Leishmania no soro. No Brasil este método diagnóstico é preconizado pelo Ministério da Saúde nos inquéritos caninos para confirmação dos casos positivos de leishmaniose visceral ao teste ELISA ou como uma técnica de diagnóstico de rotina (BRASIL, 2006). Sua sensibilidade pode chegar a 96% e a especificidade a 98%, no entanto este teste não é espécie-específico, o que dificulta a interpretação do resultado (ALVES; BEVILACQUA, 2004; BRASIL, 2006). No ano de 2008, a maioria dos casos de leishmaniose visceral humana registrados no Tocantins concentraram-se na região norte do estado, sendo confirmados 323 casos, com 18 óbitos (JUSTIÇA FEDERAL, 2008). A ampliação dos estudos acerca da

3 epidemiologia e diagnóstico da doença auxilia nos trabalhos de prevenção, controle e apoio diagnóstico da doença. Este estudo teve o objetivo de determinar a sensibilidade e especificidade da reação de imunofluorescência indireta, utilizando como antígeno cepa de Leishmania isolada de animal da cidade de Araguaína, no diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina. MATERIAL E MÉTODOS Amostras de sangue e punção aspirativa de linfonodo de cães foram obtidas de domicílios espacialmente distribuídos no município de Araguaína. A realização da coleta de material ocorreu após assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido, onde procedendo-se a contenção dos animais, sendo as amostras de sangue obtidas por meio da venopunção jugular e/ou cefálica, centrifugadas e os soros armazenados em freezer a C até a realização do teste sorológico. Para coleta de amostras de material do linfonodo, realizou-se punção aspirativa do linfonodo poplíteo ou submandibular, sendo realizado esfregaço em lâmina de microscopia que foi fixada e corada pelo método panótico. No laboratório as lâminas foram observadas em microscópio óptico de luz, pesquisando-se vários campos por um período de até 20 minutos, sendo consideradas positivas quando observada pelo menos uma forma amastigota completa. As amostras sorológicas foram analisadas por meio do teste de RIFI seguindo o protocolo descrito por Madruga et al., 2001, sendo o antígeno usado para este teste obtido através do isolamento e cultura de Leishmania de cão proveniente de Araguaína- TO. Neste teste a leitura foi realizada na objetiva de 40x em microscópio de imunofluorescência, sendo considerada como amostra positiva aquela onde foram observadas promastigotas marcadas com o conjugado fluorescente. O mesmo teste foi realizado pelo Laboratório de Patologia da Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária de Jaboticabal-SP com antígeno já padronizado. Foram calculadas a sensibilidade e a especificidade do RIFI, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo. Os cálculos foram realizados em tabelas 2x2 utilizando o programa OpenEpi Como teste padrão ouro foi utilizada a reação em cadeia de polimerase(pcr) de material colhido de linfonodo.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram coletadas 80 amostras de soro. Os resultados obtidos estão expostos na tabela 1, onde se observa que 63 amostras foram positivas na PCR (78,8%) e maior sensibilidade foi observada na RIFI realizada com antígeno isolado em Araguaína (76,2%) que na executada utilizando antígenos de Jaboticabal (65,1%). A concordância entre os dois testes foi considerada regular (k= 0,4355). Tabela 1. Distribuição dos resultados de diagnóstico da Leishmaniose em cães de Araguaina-TO por PCR e Reação de Imunofluorescência Indireta utilizando duas cepas de antígenos. PCR Total Valor preditivo positivo Valor preditivo Negativo RIFI ARAG Positivo Negativo + 48 (76,2%) 8 (47,1%) 56 85,7% 37,5% - 15 (23,8%) 9 (52,9%) 24 Total RIFI JBT + 41 (65,1%) 6 (35,3%) 47 87,2% 33,3% - 22 (34,9%) 11 (64,7%) 33 Total Os valores de sensibilidade e especificidade observados nos dois testes foram baixos, embora Lira (2005) utilizando kit-biomanguinhos para RIFI obteve 68% de sensibilidade, mas outros estudos demonstraram sensibilidade acima de 90% (ALVES; BEVILACQUA, 2004). No exame parasitológico foram diagnosticados 34(51,3%) animais positivos e, quando comparado com este método de exame, a RIFI com antígenos de Araguaína apresentou sensibilidade de 85,29% e especificidade de 40,63%. As variações observadas nos resultados aqui obtidos podem ter ocorrido também pelo fato da RIFI sofrer alteração por diferença de equipamentos utilizados pelos laboratórios e no julgamento do examinador das lâminas, que pode ser variável de acordo com o grau de fluorescência observado. A especificidade verificada utilizando a cepa Araguaína (52,9%) foi inferior aquela encontrada no RIFI utilizando a cepa Jaboticabal (64,7%), isso aumenta a possibilidade do teste identificar amostras negativas como positivas, o que pode ocorrer em decorrência de reações cruzadas com outras doenças, não sendo um resultado

5 satisfatório, visto que pode levar a indicação de eutanásia a um animal não portador da doença (ALVES; BEVILACQUA, 2004). Os resultados obtidos demonstraram que utilizando-se como antígeno promastigotas de Leishmania da região de Araguaína, obteve-se resultados próximos aos encontrados utilizando uma cepa já padronizada, de outra região, portanto a origem geográfica do antígeno provavelmente não interfere no resultado da RIFI. Devido a baixa sensibilidade e especificidade observada, recomenda-se a combinação desta técnica com outra mais sensível e específica para tornar os resultados mais confiáveis. LITERATURA CITADA ALVAR, J.; YACTAYO, S.; BERN, C. Leishmaniasis and poverty.trends in Parasitology, Oxford, v. 22, n. 12, p , ALVES, W.A.; BEVILACQUA, P.D. Quality of diagnosis of canine visceral leishmaniasis in epidemiological surveys: an epidemic in Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil, Cadernos de Saúde Pública, v. 20, n. 1, p , BRASIL. Ministério da Saúde. Secretária de Vigilância em Saúde. Departamento de Vigilância Epidemiológica. Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral. Brasília: Ministério da Saúde, BRASIL. Ministério da Saúde. Secretaria de Vigilância em Saúde. Guia de vigilância epidemiológica. Brasília (DF): Ministério da Saúde, JUSTIÇA FEDERAL Sesau prioriza combate ao calazar em 14 cidades: Araguaína é a primeira. Disponível em: < sesau-prioriza-combate-ao-calazar-em-14-cidade-araguaina-e-a-primeira>. Acessado em: 12/02/2012. LAINSON, R.; RANGEL, E. F. Lutzomyialongipalpis and the eco-epidemiology ofamerican visceral leishmaniasis, with particular reference to Brazil: a review. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, v. 100, n. 8, p , MADRUGA, C. R.; ARAÚJO, F. R.; SOARES, C. O. Imunodiagnóstico em Medicina Veterinária. Campo Grande: Embrapa Gado de Corte, MICHALSKY, E.M, et al. Infectivity of seropositive dogs, showing different clinical forms of leishmaniasis, to Lutzomyia longipalpis phlebotomine sand flies.veterinary Parasitology, v.1, p.147: 67-76, AGRADECIMENTOS "O presente trabalho foi realizado com o apoio da UFT e da Secretaria de Ciência e Tecnologia do Estado do Tocantins"

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