Profa. Dra. Fernanda de Rezende Pinto

Transcrição

1 Profa. Dra. Fernanda de Rezende Pinto

2 Urina / Soro / LCR Visualização de espiroquetas lâmina microscópio de campo escuro (objetivas: 10x e 20x) Espiroqueta x leptospira Resultado: Soro: encontrar uma ou mais espiroquetas características por morfologia e movimentos: ESPIROQUETEMIA Não encontrar espiroquetas: AUSÊNCIA DE ESPIROQUETEMIA NA AMOSTRA ANALISADA Urina: ESPIROQUETÚRIA / AUSÊNCIA DE ESPIROQUETÚRIA

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4 Leptospiras (antígeno) sofrem aglutinação na presença dos anticorpos no soro Negativo Positivo

5 Microplaca = 96 poços Luvas / jaleco Lâmina de vidro Micropipetas (mono e multicanal) Ponteiras Tubos de vidro (tampa) diluição soro e cultura Descarte: hipoclorito sódio 5% ou pinho-sol 1:256

6 Cultura de leptospiras (sorovares) Bateria de culturas da OMS + isolados locais (antígenos) Meio de cultura líquido: EMJH Solução salina fisiológica (0,85%) Soros a testar Ex: bateria de cultura Sorogrupo: Grippotyphosa / Sorovares: grippotyphosa (8) Sorogrupo: Icterohaemorragie / Sorovares: copenhagi (10A); lai (10G)

7 Controles Positivos e negativos Controle positivo: soro positivo (Acs contra leptospira) mais de um sorovar Controle negativo interno (sem soro) 20µL Ag + 20µL sol. salina Microscópio de campo escuro (objetivas 10x, 20x e 40x) Estufa 30ºC

8 Considerar reação positiva na sorologia de triagem (título) Humano e caninos domiciliados: 1/25 Sinais: 2 a 3 dpi médico Dono do cão visualiza início dos sinais clínicos Bovinos: 1/100 Aborto ajuda veterinário (tempo maior produção maior de Acs) Janela imunológica tempo que o sistema imune necessita para produzir Acs em nível suficiente para ser detectado

9 Usar um sorovar de cada sorogrupo (no mínimo) Sorovares locais Sorovares de mesmo sorogrupo: determinantes antigênicos comuns reação cruzada entre sorovares Também pode ocorrer reação cruzada entre sorogrupos diferentes

10 Tubo com cultura de leptospiras (meio líquido EMJH) Olhar contra a luz contaminação Densidade (quantidade de leptospiras densidade) 1 gota lâmina: MCE contagem (verificar o nº lept. por campo, se há auto-aglutinação) Repique semanal: 10% volume para outro tubo 2 a 3 dias (30 C) Usar como antígeno no teste: 7 a 14 dias no meio

11 Poços da primeira linha (A) colocar o controle negativo interno do teste (antígeno = cultura de leptospira e solução salina) 20 µl Ag + 20 µl sol.

12 Linha A: colocar o Ag diluído em salina (diferentes sorovares em cada poço) 20 µl sol. salina + 20 µl do Ag CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro) A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4 B C D E F G H

13 Diluição do soro sempre a metade do ponto de corte da leitura do resultado Humano ou cão domiciliado: diluição do soro adicionado à microplaca: 1: 12,5 Bovino: 1: 50 Quando se adiciona o Ag o volume final no poço da microplaca dobra, e assim, a diluição também dobra (1:25 e 1:100)

14 Primeiro faz a diluição inicial 1:5 100 µl do soro em 400 µl de solução salina Soro diluído 1:5 100 µl do soro teste 400 µl salina

15 Em seguida, faz a segunda diluição: a partir da diluição 1:5. A segunda diluição é metade do valor da diluição de leitura no teste Ex: Leitura 1:25 Diluição do soro: 1:12,5 (Humano, cão) Soro diluído 1:5 Diluição 1:12,5 400 µl do soro diluído 1: µL salina

16 Segunda diluição: a partir da diluição 1:5 Leitura 1:100 Diluição do soro: 1:50 (bovino) Soro diluído 1:5 Diluição 1: µl do soro diluído 1: µl salina

17 2º: 20µL do Ag (em cada soro a ser testado) 1 / 100 (dobro volume e dilui para 1:100) O Ag é a cultura de leptospira mantida em tubo de vidro no meio de cultura líquido EMJH. CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro) Cada linha B até H: Soro a testar B = soro do bovino 1 C = soro do bovino A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4 B C D E F G H 1º: 20µL do soro (diluído 1 / 50 ) do bovino 1

18 CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro) Cada linha B até H: Soro a testar B = soro do bovino 1 C = soro do bovino A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4 B C D E F G H Agitar a placa agitador de placa para homogeneizar Incubar em estufa a 30ºC por 1 a 3 horas

19 Agitar a placa agitador de placas Estufa 30 C por 1 a duas horas Diluição do soro, reação (manhã) Leitura: logo após almoço Leitura dos resultados: microscópio de campo escuro visualizar se há aglutinação (Ag + Acs soro)

20 Soros a testar 1ª gota controle negativo interno (sem soro) = Ag com leptospiras livres Verificar se não há aglutinação nas leptospiras do antígeno (auto-aglutinação) Comparar o controle negativo interno com os soros a testar 1 gota (3 a 5 µl) placa Objetiva de 10 x Tempo de leitura não > 1,5 hora

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22 Reação positiva para aglutinação: redução maior que 50% das leptospiras vivas (livres) Aglutinação em mais de 50% Redução da densidade do Ag = aglutinação

23 Negativo Positivo Soro (anticorpos) + antígeno (leptospiras)

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25 Resultado: não é o título final do soro do bovino! Informa apenas: reação positiva ou negativa (título é fixo no teste) para um sorovar Teste de triagem: indica a presença de Acs no soro, mas não necessariamente a presença da doença Soros reagentes na triagem sorologia / titulação

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27 Testar o soro com sorovares que apresentaram reação positiva (aglutinação) no teste de triagem Usar apenas os sorovares que reagiram com o soro teste na sorologia de triagem Diluição seriada nos soros a testar (diluições dobradas) Indica a titulação real do animal/pessoa

28 Soro humano (diluições possíveis em uma microplaca) 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 Soro bovino 1:100 1:200 1:400 1:800 1: : :6.400

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30 CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro) Em cada pocinho da primeira linha (por coluna) Antígeno ( 20µL de sol. Salina + : 20µL do Ag) = controle negativo interno A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4 B 1:25 C 1:50 D 1:100 E 1:200 F 1:400 G 1:800 H 1:1600 Cada coluna (B até H): um soro a testar para cada sorovar (Ag) Cada linha é uma diluição do soro teste (diluições seriadas)

31 CONTROLE NEGATIVO (sem soro) Em cada pocinho da primeira linha (por coluna) Antígeno ( 20µL de sol. Salina + : 20µL do Ag) A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4 B 1:25 C 1:50 D 1:100 E 1:200 F 1:400 G 1:800 H 1:1600 1º: Cada coluna (C até H): 20µL de sol. Salina 2º: Poço B: 40 µl do soro diluído 1:12,5 (sem salina)

32 Diluição seriada do soro teste: 20 µl soro 1:12,5 (B) Poço C (1:25) Poço D (1:50) Poço E (1:100) Poço F (1:200) Poço G (1:400) Poço H (1:800) desprezar 20 µl finais A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4 B 1:25 C 1:50 D 1:100 E 1:200 F 1:400 G 1:800 H 1:1600 Adicionar 20 µl do Ag (cultura de sorovar de leptospira mantido em tubo de vidro com meio de cultura EMJH) em cada poço com soro dobro o volume contido no poço dobro a diluição alcança o título de leitura do soro

33 Agitar a placa agitador de placas Estufa 30 C por 1 a duas horas Leitura Microscópio de campo escuro visualizar se há aglutinação (Ag + Acs soro)

34 Soros a testar 1:25 1:100 1:400 1:1600 1:50 1:200 1:800 1ª gota controle negativo (sem soro) Cultura de leptospiras Se não há aglutinação Comparar com os soros a testar 1 gota (3 a 5 µl) placa Objetiva de 10 x ou 20X Tempo de leitura não > 1,5 hora

35 Fechar diagnóstico: Clínica + Epidemiológico + Título Bovino: Aborto + Roedores/Aguada + título > 1:400 Sorovar infectante: título mais alto 2 sorovares com mesmo título: resultado positivo para os dois títulos (reação cruzada ou infecção pelo 2) Diluir mais o soro descobrir qual desses 2 sorovares é infectante (título mais alto) Ou infecção por um sorovar não existente na bateria

36 Diferenciar sorovar: estudos epidemiológicos ou vacinação Para clínica não interessa: tratamento é o mesmo Título vacinal: bovino até 6 meses pós vacinação Título 1:400 Perguntar: quando foi a vacinação, para quais sorovares Sem clínica nem evidência epidemiológica = vacinal

37 Título vacinal: bovino até 6 meses pós vacinação Título 1:400 Tem clínica + epidemiológico Título alto de sorovar diferente do encontrado na vacina doença

38 Ideal é fazer diagnóstico sorológico populacional Amostra representativa: Animais que abortaram (3-4 dias após aborto queda imunidade sem Acs) + outras categorias Títulos altos e baixos Vaca aborto + > 1:400 infectado (não precisa novo teste) 1:100 (início ou fim infecção dias (PI: 2-14 dias, média 7 d) nova coleta soroconversão

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