PAULO EDUARDO BRANDÃO, PhD DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA E SAÚDE ANIMAL FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA UNIVERSIDADE

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1 PAULO EDUARDO BRANDÃO, PhD DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA E SAÚDE ANIMAL FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

2 1. DEFINIÇÃO 2. PRINCÍPIO 3. APLICAÇÕES 4. EXEMPLOS DE USO COM REED E MUENCH

3 DEFINIÇÃO SORONEUTRALIZAÇÃO REAÇÃO SOROLÓGICA BASEADA NA PERDA (NEUTRALIZAÇÃO) DA INFECTIVIDADE OU TOXIDADE IN VIVO OU IN VITRO DE UM DETERMINADO AGENTE INFECCIOSO (VÍRUS, BACTÉRIAS ETC) OU DE TOXINAS APÓS INTERAÇÃO COM ANTICORPOS (SORO)

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5 PRIMÓRDIOS DA SORONEUTRALIZAÇÃO

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7 PRINCÍPIO SORONEUTRALIZAÇÃO INTERAÇÃO DE BASE IMUNOLÓGICA ENTRE IMUNOGLOBULINAS E SUAS PROTEÍNAS-ALVO ESPECÍFICAS (TOXINAS, PROTEÍNAS VIRAIS) QUE BLOQUEIA A LIGAÇÃO ENTRE ESTAS E SEUS RECEPTORES CELULARES, IMPEDINDO A MANIFESTAÇÃO DOS EFEITOS DO PATÓGENO EM QUESTÃO

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9 EFEITO CITOPÁTICO TODOS OS VÍRUS CAUSAM EFEITO CITOPÁTICO?

10 SINAL ESPERADO APÓS VACINAÇÃO OU SOROTERAPIA (IN VIVO): AUSÊNCIA DE SINTOMAS E SINAIS SINAL ESPERADO APÓS SORONEUTRALIZAÇÃO (IN VIVO OU IN VITRO): AUSÊNCIA DE EFEITO CITOPÁTICO, CITOTÓXICO (CULTIVO CELULAR) OU SINTOMAS (ANIMAIS DE LABORATÓRIO)

11 NEUTRALIZAÇÃO TEM CORRELAÇÃO TOTAL COM PROTEÇÃO?

12 PRINCÍPIO SORONEUTRALIZAÇÃO

13 PRINCÍPIO Y Y Y Y Y Y

14 PRINCÍPIO CLASSES DE ANTICORPOS NEUTRALIZANTES IgG (ATIVAÇÃO DE COMPLEMENTO, RESPOSTA EFETORA CELULAR)

15 PRINCÍPIO CLASSES DE ANTICORPOS NEUTRALIZANTES IgA (ATIVAÇÃO DE COMPLEMENTO, OPSONIZAÇÃO)

16 PRINCÍPIO CLASSES DE ANTICORPOS NEUTRALIZANTES IgM (FIXAÇÃO DE COMPLEMENTO, MARCADOR DE SUPERFÍCIE DE LφB)

17 PRINCÍPIO SORONEUTRALIZAÇÃO CLASSES DE ANTÍGENOS ENVOLVIDOS ANTÍGENOS DE SUPERFÍCIE DE VÍRUS, BACTÉRIAS

18 PRINCÍPIO IMUNOGLOBULINAS NEUTRALIZANTES + EPÍTOPOS ALTERAÇÃO DO PONTO ISOELÉTRICO (ph de carga elétrica neutra) ALTERAÇÃO DA PROPORÇÃO ENTRE CARGAS POSITVAS E NEGATIVAS ALTERAÇÕES CONFORMACIONAIS PERDA DA ESTRUTURA PARA ESPECIFICIDADE DE LIGAÇÃO PROTEÍNA DO PATÓGENO X RECEPTOR CELULAR SENSIBILIDADE À DESNATURAÇÃO

19 SARS-CoV DOMÍNIO DE LIGAÇÃO A RECEPTOR CELULAR Fab NEUTRALIZANTE

20 PRINCÍPIO Ig oligoméricas (IgM, siga) Adsorção antígeno-receptor Ig monoméricas (IgG, IgA) Ação intracelular* (ex: replicação viral)

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23 MAS,... SORONEUTRALIZAÇÃO

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25 EM ANIMAIS Soroneutralização positiva VÍRUS, TOXINAS + SORO Soroneutralização negativa X

26 EM CULTIVO CELULAR Soroneutralização positiva VÍRUS + SORO Soroneutralização negativa

27 EM MEIOS DE CULTIVO Soroneutralização negativa BACTÉRIAS + SORO Soroneutralização positiva

28 PRINCÍPIO SINAL X RELAÇÃO AGENTE/SISTEMA BIOLÓGICO CITOPATOGENICIDADE, CITOTOXICIDADE, SINTOMAS OBSERVAÇÃO DIRETA DO SINAL PATÓGENO É ISOLÁVEL, MAS NÃO CAUSA CITOPATOGENICIDADE, CITOTOXICIDADE, SINTOMAS REAÇÃO SOROLÓGICA SUBSEQÜENTE PARA EVIDENCIAR A NEUTRALIZAÇÃO

29 PRINCÍPIO (EX: VÍRUS SEM EFEITO CITOPÁTICO) Soroneutralização negativa 1 2 VÍRUS + SORO IF Soroneutralização positiva

30 ESPECIFICIDADE: GRAU DE EXCLUSIVIDADE DE RECEPTORES CELULARES X ANTI- RECEPTORES (VÍRUS, TOXINAS) Ig NEUTRALIZANTES ( PRECIPITANTES, FIXADORES DE COMPLEMENTO OU INIBIDORES DE HEMAGLUTINAÇÃO)

31 SENSIBILIDADE: Ig NEUTRALIZANTES (NÃO DETECTA AC PRECIPITANTES, FIXADORES DE COMPLEMENTO OU INIBIDORES DE HEMAGLUTINAÇÃO)

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33 INTERFERÊNCIA DO AGENTE NA ESPECIFICIDADE SORONEUTRALIZAÇÃO

34 INTERFERÊNCIA DO SISTEMA COMPLEMENTO

35 INTERFERÊNCIA DO SISTEMA COMPLEMENTO AQUECIMENTO DO SORO A 56ºC INATIVAÇÃO DO COMPLEMENTO, SEM COMPROMETIMENTO DOS Ac Jules Bordet

36 APLICAÇÕES -IDENTIFICAÇÃO SOROLÓGICA -SORODIAGNÓSTICO IDENTIFICAÇÃO/CONFIRMAÇÃO DE VÍRUS, BACTÉRIAS EM AMOSTRAS CLÍNICAS MENSURAÇÃO DE TÍTULOS DE ANTICORPOS (SOROEPIDEMIOLOGIA, SOROCONVERSÃO) IDENTIFICAÇÃO DE TOXINAS BACTERIANAS

37 EXEMPLO DE USO TITULAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-VÍRUS DA INFLUENZA PRESSUPOSTOS VÍRUS FIXO DE TÍTULO CONHECIDO SORO EM ESTUDO: TÍTULO DESCONHECIDO INTERPOLAÇÕES TÍTULO DO SORO EM QUESTÃO

38 1º-) TITULAÇÃO DO VÍRUS DE REFERÊNCIA (DOSES INFECTANTES PARA CULTIVO CELULAR= DICT) CULTIVO DE CÉLULAS MDCK CULTIVO DE CÉLULAS MDCK VÍRUS DE REFERÊNCIA: DILUIÇÕES 10-1 a REPETIÇOES POR DILUIÇÃO INOCULAR 100µL DE CADA DILUIÇÃO

39 1º-) TITULAÇÃO DO VÍRUS DE REFERÊNCIA (DOSES INFECTANTES PARA CULTIVO CELULAR= DICT)

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41 1º-) TITULAÇÃO DO VÍRUS DE REFERÊNCIA (DOSES INFECTANTES PARA CULTIVO CELULAR= DICT) Diluição Nº poços + (COM EFC) / / / / / /10 TÍTULO =10 X

42 INDIVÍDUOS/ POÇOS DE CULTIVO CELULAR QUE TENHAM REAGIDO A UMA DOSE DE DETERMINADO ESTÍMULO REAGIRÃO A DOSES MAIS ELEVADAS DESTE ESTÍMULO INDIVÍDUOS/ POÇOS DE CULTIVO CELULAR QUE NÃO TENHAM REAGIDO A DETERMINADA DOSE NÃO REAGIRÃO A DOSES MAIS BAIXAS DOSE A QUAL METADE DOS INDIVÍDUOS REAGE E METADE NÃO REAGE =?

43 1º TITULAÇÃO DO VÍRUS DE REFERÊNCIA Reed e Muench REED, L. J.; MUENCH, H. American Journal of Hygiene, 27:493, Diluição Nº poços + +acumulados - acumulados % / (35/35) / (25/25) / (15/15) / (5/11) / (1/16) / (0/25) TÍTULO =10 X

44 1º TITULAÇÃO DO VÍRUS DE REFERÊNCIA Reed e Muench Diluição % (35/35) (25/25) (15/15) (5/11) (1/16) (0/25) Fator = 50% - % abaixo 50% x log fator diluição % acima 50% - %abaixo 50% Fator = (50 45)/ (100 45) x 1= 5/55= 0,091 TÍTULO VIRAL = ,091 = 10 3,909 = 10 3,909 DICT 50% / 100µL vírus SIGNIFICA QUE À DILUIÇÃO DE 10-3,909 HÁ 1 DICT 50%

45 2º TITULAÇÃO DO SORO DESCONHECIDO 1. Diluição do soro desconhecido : 10-1 A µl de cada diluição µl DE 100 DICT50 DO VÍRUS DE REF ºC + 5% CO 2 / 1 h µl DAS COMBINAÇÕES VÍRUS/SORO EM CÉLULAS MDCK 5. 37ºC + 5% CO2/ 24 h 6. OBSERVAÇÃO DE EFEITO CITOPÁTICO 7. Cálculo do título: Reed e Muench

46 2º TITULAÇÃO DO SORO DESCONHECIDO Diluição do soro Nº poços + +acumulados - acumulados % / %(28/38) / %(28/48) / %(28/54) / %(24/54) / %(18/50) / %(10/42)

47 2º TITULAÇÃO SORO DESCONHECIDO Reed e Muench Diluição do soro % % % % % % Expoente = 50% - % abaixo 50% x log fator diluição % acima 50% - %abaixo 50% Expoente = (50 44)/ (52 44) x 1= 0, % TÍTULO = ,75 = 10 3,25 Doses Inibitórias µL soro

48 PAULO EDUARDO BRANDÃO, PhD DEPARTAMENTO DE MEDICINA VETERINÁRIA PREVENTIVA E SAÚDE ANIMAL FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO paulo7926@usp.br