Diagnóstico de infecções virais
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- Miguel Ramalho Sampaio
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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE LABORATÓRIO DE VIROLOGIA Diagnóstico de infecções virais Equipe de Virologia UFRGS & IPVDF
2 Diagnóstico de infecções virais Duas formas Buscar o vírus Métodos diretos Buscar a resposta do organismo Métodos indiretos
3 Buscar o vírus Métodos diretos: utilizados na detecção do vírus, antígenos ou genomas virais: Microscopia eletrônica Isolamento viral Detecção imunológica (IPX ou IF) Hemaglutinação (HA) ELISA direto PCR, RT-PCR, Real-time PCR Sequenciamento
4 Permite a visualização de partículas víricas viáveis e também inviáveis Aplicável virtualmente a todos os vírus Identificação definitiva do agente Desvantagens: Caro Microscopia eletrônica Baixa sensibilidade Mão de obra especializada Megavirus chilensis Fonte:
5 Isolamento em cultivo celular Identificação pela produção do efeito citopático (ECP) característico Exige vírus viável Boa sensibilidade Não aplicável a muitos vírus Disponibilidade de linhagens celulares
6 Qual célula utilizar Os vírus são espécie-específicos, mas alguns conseguem se multiplicar em células da espécie homóloga BVDV: céls de bovinos, ovinos, suínos, carnívoros e primatas PRRSV: céls MARC-145 (céls de primata) EHV: céls VERO (primata) e RK-13 (coelho) Influenza: MDCK (canina) BoHV: MDBK, CRIB, VERO, etc
7 Efeito citopático (ECP) É o dano que o vírus causa à célula lise arredondamento vacuolização formação de sincícios inclusões picnose apoptose
8 Efeito citopático (ECP) Adenovírus em células 293A Fonte: Knak et al., in prep
9 Isolamento viral Obtenção do vírus viável permite a sua caracterização e estudos posteriores Detecção de antígenos ou ácidos nucleicos Neutralização com soro imune específico Desvantagens: caro, demorado, risco de contaminações
10 Outras formas de detecção direta do vírus Inoculação em animais Ex.: em camundongos lactentes para o diagnóstico conclusivo da raiva Inoculação em ovos embrionados Tecidos, suabes Visando o isolamento viral
11 Outras formas de detecção direta do vírus
12 Outras formas de detecção direta do vírus Lesões: 2 a 7 dias PI morte embrionária, nanismo, enrolamento embrionário e hemorragias cutâneas
13 Hemaglutinação (HA) Observação da capacidade do vírus de aglutinar hemácias Vantagens: rápida, boa sensibilidade e especificidade e de fácil execução Desvantagens: aplicável a um grupo restrito de vírus Necessidade de espécies doadoras de hemácias (cobaias, coelhos ou galinha)
14 Hemaglutinação (HA) Alguns vírus possuem estruturas capazes de se ligar a receptores específicos de hemácias de determinadas espécies e produzir o fenômeno da HEMAGLUTINAÇÃO Essas estruturas são as hemaglutininas (glicoproteínas de superfície dos virions)
15 Hemaglutinação (HA) Alguns vírus com capacidade hemaglutinante Influenza Parainfluenza Adenovírus bovino, equino, canino Parvovírus Doença de Newcastle Bronquite infecciosa das galinhas
16 Mecanismo / Princípio Hemaglutinação (HA) Rede de hemácias que não se acumulam no fundo do poço Hemácias acumuladas no fundo do poço
17 Hemaglutinação (HA) Interpretação Reação positiva: presença de vírus Reação negativa: ausência de vírus Reação negativa: ausência de vírus
18 1º PBS Hemaglutinação (HA)
19 2º Vírus Hemaglutinação (HA)
20 Hemaglutinação (HA) 3º Diluição do vírus 25μl
21 Hemaglutinação (HA) 4º Hemácias a 1%
22 Detecção de antígenos virais Utiliza anticorpos específicos Método mais utilizado para detecção e identificação viral Diferentes amostras: secreções, tecidos ou céls de cultivo inoculadas IPX, Imunofluorescência, ELISA
23 Detecção de antígenos virais Vantagens: alta sensibilidade e especificidade Rapidez, baixo custo e facilidade de execução Kits comerciais ampliaram e popularizaram o uso
24 Imunoperoxidase (IPX) É uma técnica de detecção de antígeno (Ag) utilizada no diagnóstico de infecções víricas Baseia-se na reação de anticorpos (Ac) específicos com o antígeno presente no material suspeito Imunocitoquímica: monocamadas celulares Imunoistoquímica: diretamente em tecidos
25 IPX
26 IPX - IPX indireta é mais sensível Ampliação do sinal!
27 IPX Resultado negativo Resultado positivo
28 Imunofluorescência Tb é uma técnica baseada na reação antígeno-anticorpo Proteínas virais são detectadas por Ac conjugados com marcador fluorescente Rápida, fácil, apresenta boa sensibilidade e especificidade Detecta tb vírus inviável
29 Disponível em kits Desvantagens: Imunofluorescência Podem ocorrer reações inespecíficas Reagentes para alguns vírus podem não ser disponíveis Aplicação: imunofluorescência direta para o diagnóstico do vírus da raiva
30 Imunofluorescência direta Diagnóstico da raiva Amostras de cérebro suspeitas Impressão tecidual em lâminas (imprint) Anticorpo marcado com FITC sobre material infectado Visualização em microscópio de fluorescência
31 Imunofluorescência direta Cérebro de raposa positivo para o vírus da raiva (CDC, 1958) Fonte:
32 ELISA Baseia-se na identificação de anticorpos e/ou antígenos, por anticorpos marcados com uma enzima, de maneira que esta enzima age sobre um substrato e a reação faz com que o cromógeno mude de cor Tipos de ELISA: indireto, direto, competitivo
33 ELISA direto Anticorpos imobilizados em placas de poliestireno detectam o vírus presente na amostra Rápida, sensível, específica, automatizável, disponível em kits, Desvantagens: kits comerciais são caros e podem apresentar falhas na detecção (falsos-negativos)
34 ELISA direto Também denominado sanduiche Utilizado para detecção de antígenos Anticorpo primário específico ao antígeno é adsorvido no poço da microplaca Adiciona-se o antígeno O segundo anticorpo específico ao antígeno é marcado com uma enzima é adicionado
35
36 Detecção de ácidos nucleicos PCR, Nested PCR, multiplex PCR RT-PCR Real-time PCR Sequenciamento Alia alta sensibilidade e especificidade Aplicável a todos os vírus Rápida e automatizável
37 Detecção de ácidos nucleicos PCR Nested PCR Multiplex RT-PCR
38 Detecção de ácidos nucleicos PCR Primers específicos para o vírus Padronização visando alta sensibilidade Novo ciclo de amplificação via uma nested PCR: aumenta sensibilidade e especificidade
39 Nested PCR 570 pb Produto da 1ª PCR BoHV-1 BoHV pb 236 pb
40 Real time PCR Detecção da amplificação associada a cada ciclo durante a PCR Quantificação do DNA ou RNA viral (cdna) Ciclos ultra-rápidos (30 min a 2 horas) Nenhuma análise no final da reação de PCR
41 Real time PCR Fonte:
42 Equipamento: ABI 3500xl Sequenciamento Análise do cromatograma Fonte: /
43 Sequenciamento Sequência > Blast > Identificação do vírus 5 TATGGAGAAGGAAGAGCCCGATACGCTCGCACCACGAGCTTCACGTGACGCTCCGGG GACGCCAAAAGTGCCCGCGATGCCCGGTGTGACCCCGGAGCCATCAGGAAACGCCTC GGAGCCCGCCGACCCGGCGGAGCTCCGGGCGGACTTGCGGGGTCTAAAAGGCTCCA GCGACGATCCTAATTTCTACGTGTGCCCCCCTCCCACCGGTGCGACCGTGGTGCGGCT CGAGGAGCCGCGCCCGTGCCCGGAGTTGCCCAAGGGGCTCAACTTCACCGAGGGCAT CGCCGTAACTTTCAAGGAGAACCTCGCGCCGTACAAGTTTAAGGCCACTATGTACTACAA GGCCGTGACTGTCGCTAGCGTGTGGTCCGGGTACTCGTATAACCAGTTTATGAATATCTT TGAGGACCGTGCCCCTATACCGTTCGAGGAAATCGTCGACCGGATACACGGCCGGGGT ATGTGTTTGTCCACGGCAAAGTACGTCAGGAACAACCTTGAGACCACCGCATTCCATAAT GATGCCGACGAACATGAGATGAAGCTGGTGCCCGCCGAGTCCGCCCCTGGGTTGCATC GCGGATGGCACACCACGCGGCTAAAAA3
44 Sequenciamento
45 Sequenciamento
46 Sequenciamento
47 Buscar a resposta do organismo Quando ocorre contato com o vírus Detecção de anticorpos Métodos indiretos: Soro-neutralização Inibição da hemaglutinação (HI) Imunofluorescência indireta ELISA indireto
48 Detecção de anticorpos antivirais Técnicas de detecção de anticorpos são tb denominados testes sorológicos Importância na epidemiologia: prevalência e distribuição de infecções virais Resultados dos exames sorológicos devem ser interpretados de acordo com a biologia e epidemiologia do agente e da resposta imunológica do hospedeiro
49 Inibição da Hemaglutinação Anticorpos antivirais impedem a atividade hemaglutinante do vírus Rápida, sensível, especifica, custo baixo Somente aplicável a vírus hemaglutinantes Requer animais doadores de hemácias Não automatizável
50 Inibição da Hemaglutinação Detecção de anticorpos capazes de inibir a atividade aglutinante de alguns vírus
51 Inibição da Hemaglutinação Resultado positivo PRESENÇA DE ANTICORPOS Resultado negativo AUSÊNCIA DE ANTICORPOS
52 Soroneutralização Anticorpos presentes no soro previnem a replicação viral e a produção de ECP nas células Vantagens: sensível, especifica, qualitativa e quantitativa Anticorpos anti-bohv Foto: Fabrício Campos Foto:
53 Soroneutralização Obj.: avaliar o título de anticorpos neutralizantes Determinar nível de imunidade de uma população Determinar poder imunogênico de vacinas Desvantagens: exige cultivo celular, toxicidade do soro Detecta somente anticorpos neutralizantes Somente vírus que replicam em cultivo
54 Soroneutralização Vírus desafio previamente conhecido e quantificado Teste realizado em microplacas de 96 cavidades Incubação das diluições crescentes do soro-teste com uma quantidade constante de vírus (100 DICC 50 ) 1h a 24h de incubação (OIE: 24hs) Adição das células de cultivo Soro-vírus-célula (37 C; 5% de CO 2 ; 48 a 96h).
55 Calculo de dose infectante Vírus Estoque: Título = DICC dil. 2 dil. 3 dil. 4 dil. 5 dil. 6 dil. 7 dil. MEM Vírus 900 ul 100 ul 900 ul 100 ul 900 ul 100 ul 900 ul 100 ul 900 ul 100 ul 900 ul 100 ul 900 ul 100 ul 100 DICC DICC 50 1 DICC 50 0,1 DICC 50 DICC 50 = Doses infectantes em 50% do cultivo celular
56 Soroneutralização soro teste vírus suspeito 24 horas células + -
57 Soroneutralização Leitura: 48-96h VÍRUS CITOPÁTICO + - Presença de Ac neutralização viral ausência de efeito citopático Ausência de Ac vírus livre presença de efeito citopático
58 Soroneutralização Leitura: 48-96h VÍRUS NÃO CITOPÁTICO + - Presença de Ac neutralização viral ausência de efeito citopático Ausência de Ac vírus livre presença de efeito citopático
59 Soroneutralização VÍRUS NÃO CITOPÁTICO IPX
60 Soroneutralização
61 Imunofluorescência indireta Anticorpos presentes no soro se ligam a antígenos imobilizados e são detectados por anticorpos marcados com FITC Vantagens: rápida e simples Desvantagens: risco de reações inespecíficas Reagentes para alguns vírus podem não ser disponíveis
62 Imunofluorescência indireta Imunofluoresncencia indireta feita com soro de galinha em células Vero infectadas com virus West Nile Fonte: - Figure
63 ELISA INDIRETO Utilizado para detecção de anticorpos Antígeno fica aderido aos poços da microplaca Adiciona-se o soro Em seguida um anticorpo marcado com uma enzima que reage com o substrato fazendo com que o cromógeno mude de cor
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65 Limitações da sorologia Detecta exposição, mas não quando ela ocorreu Considerar a cinética de replicação dos vírus para escolher o teste diagnóstico Sugestão de leitura: Capitulo 11: Diagnóstico Laboratorial das Infecções Víricas do livro Virologia Veterinária; Flores, 2007.
66 Cinética da replicação viral Fonte: Flores, 2007
67 Grato pela atenção!
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