Técnicas de Imuno-Citoquímica e Imuno-Histoquímica

Transcrição

1 Técnicas de Imuno-Citoquímica e Imuno-Histoquímica Doutorando: Romeu Moreira dos Santos Prof. Hélio José Montassier Disciplina: Imunologia Veterinária

2 Linfócitos T Seleção e maturação de células T TCR αβ se transformam em CD4+ ou CD8+ na medula tímica T CD4+ virgem : MHC de antígenos exógenos T CD8+ virgem : MHC de antígenos endógenos classe IIclasse I

3 Linfócitos B Linfócitos B são ativados pelo antígeno secretam anticorpos para eliminá-los e Citocinas produzidas pelas céls T auxiliares que são ativadas por patógenos regulam a mudança do isótipo

4 Marcadores

5 Técnica - definição Utilização de Acs para detecção do antígeno distribuído no tecido ou no compartimento de uma célula Histoquímica Corte de tecido congelado ou parafinado Citoquímica Esfregaço sanguíneo, aspirados ou suabes

6 Principais fatores Qualidade da marcação: A. Fase pré-analítica (destacando-se fixação do tecido e processamento); B. Recuperação epítopos; antigênica de C. Sensibilidade detecção. do sistema de

7 História Coons, Creech e Jones em 1941 Conjugaram um fluorescente. anticorpo com um corante Novos compostos marcadores como as enzimas horseradish peroxidase (HRP) em 1966 e fosfatase alcalina em 1978

8 Aplicações

9 Pré-requisitos

10 Antígeno - Anticorpo Antígeno: molécula que se une de maneira específica a um anticorpo Epítopo: sítios de reconhecimento de ligação Imunógeno: molécula que pode desencadear uma reposta Peptídeos sintéticos Antígeno purificado ou

11 Soros Reagente da técnica Imunização de animais-alvo Soros policlonais e monoclonais

12 Soros policlonais Vários plasmócitos Reage com diversos epítopos antígeno de um Coelho, cabra, porco, equino ou ovelha

13 Soros monoclonais Produto de um único clone de plasmócitos Uniforme em estrutura, especificidade e afinidade Anticorpos de um clone - imunoquimicamente idênticos e reagem com um epítopo específico Ratos

14 Métodos Imunohistoquímicos Métodos diretos AC primário possui o marcador Simples, rápido Pouca ampliação de sinal

15 Métodos indiretos Método indireto simples Anticorpo primário Anticorpo secundário possui o marcador Mais sensível que o método direto, maior versatilidade, mais econômico Mais demorado orado e mais e comcomplexo do que o direto

16 Métodos de avidina-biotina Detecta pequenas quantidade de antígenos Alta sensibilidade (1 molécula de anticorpo se liga a 150 moléculasde biotina ) diminui o fundo Técnica mais rápida Alta versatilidade

17 Métodos de avidina-biotina Técnica streptabc Anticorpo primário Anticorpo secundário biotinilado Aplicação do complexo streptavidinabiotina (marcado com substância propiciadora da visualização - normalmente HRP).

18 Aspecto prático dos reagentes Cuidado com material e reagentes Diluição do anticorpo Testar diluições diferentes Pipetagem Tempo e temperatura de incubação Higiene e segurança do laboratório

19 Preparação de amostras Fixação Preservação Estabilização Proteção

20 Preparação de amostras Formaldeído Econômico, mais utilizado, penetra tecidos nos Pontes de metileno entre os aminoácidos de várias proteínas Máscarar antígenos Algumas alterações estruturais nas biomoléculas, principalmente nas proteínas Recuperação antigênica

21 Preparação de amostras Fixação para cortes de criostato > preservação dos tecidos Fixadores: álcool, acetona

22 Microtomia Cortes finos, sem pregas ou estrias Não desbastar os cortes entre HE e IHQ

23 Recuperação antigênica Cortes parafinados Digestão enzimática proteolítica Recuperação antigênica de origem térmica por alta temperatura Forno de micro-ondas, autoclave, panela de pressão, banho de água quente e vapor quente

24 Inibição de partículas endógenas Peroxidase endógena Baço, Rins, Fígado, Medula em áreas de necrose óssea e Bloqueada por um excesso de substrato ( H2O2) que leva à saturação da atividade enzimática Fosfatase alcalina Rim, fígado e osso

25 Figura 92 - Receptores de Estrogênio Figura CD3 (negro) e CD20 (castanho) em gânglio linfático

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