Z O O N O S E S E A D M I N I S T R A Ç Ã O S A N I T Á R I A E M S A Ú D E P Ú B L I C A LEPTOSPIROSE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

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1 Z O O N O S E S E A D M I N I S T R A Ç Ã O S A N I T Á R I A E M S A Ú D E P Ú B L I C A LEPTOSPIROSE DIAGNÓSTICO LABORATORIAL

2 1. PESQUISA DIRETA DE ESPIROQUETA Urina / Soro / LCR Visualização de espiroquetas lâmina microscópio de campo escuro (objetivas: 10x e 20x) Resultado: Soro: encontrar uma ou mais espiroquetas características por morfologia e movimentos: ESPIROQUETEMIA Não encontrar espiroquetas: AUSÊNCIA DE ESPIROQUETEMIA NA AMOSTRA ANALISADA Urina: ESPIROQUETÚRIA / AUSÊNCIA DE ESPIROQUETÚRIA

3 2. SOROLOGIA PARA LEPTOSPIROSE TRIAGEM TESTE DA SOROAGLUTINAÇÃO MICROSCÓPICA (MAT)

4 SOROAGLUTINAÇÃO Leptospiras (antígeno) sofrem aglutinação na presença dos anticorpos no soro Negativo Positivo

5 MATERIAL Microplaca = 96 poços Luvas / jaleco Lâmina de vidro Micropipetas (mono e multicanal) Ponteiras Tubos de vidro (tampa) diluição soro e cultura Descarte: hipoclorito sódio 5% ou pinho-sol 1:256

6 MATERIAL Cultura de leptospiras (sorovares) Bateria de culturas da OMS + isolados locais (antígenos) Meio de cultura líquido: EMJH Solução salina fisiológica (0,85%) Soros a testar Ex: bateria de cultura Sorogrupo: Grippotyphosa / Sorovares: grippotyphosa (8) Sorogrupo: Icterohaemorragie / Sorovares: copenhagi (10A); lai (10G)

7 MATERIAL Controles Positivos e negativos Controle positivo: soro positivo (Acs contra leptospira) mais de um sorovar Controle negativo interno (sem soro) 20µL Ag + 20µL sol. salina Microscópio de campo escuro (objetivas 10x, 20x e 40x) Estufa 30ºC

8 PONTO DE CORTE POR ESPÉCIE Considerar reação positiva na sorologia de triagem (título) Humano e caninos domiciliados: 1/25 Sinais: 2 a 3 dpi médico Dono do cão visualiza início dos sinais clínicos Bovinos: 1/100 Aborto ajuda veterinário (tempo maior produção maior de Acs) Janela imunológica tempo que o sistema imune necessita para produzir Acs em nível suficiente para ser detectado

9 SOROVARES - OMS Usar um sorovar de cada sorogrupo (no mínimo) Sorovares locais Sorovares de mesmo sorogrupo: determinantes antigênicos comuns reação cruzada entre sorovares Também pode ocorrer reação cruzada entre sorogrupos diferentes

10 CULTURA DE SOROVARES DE LEPTOSPIRA Tubo com cultura de leptospiras (meio líquido EMJH) Olhar contra a luz contaminação Densidade (quantidade de leptospiras) 1 gota lâmina: MCE contagem (verificar o nº lept. por campo, se há auto-aglutinação) Repique semanal: 10% volume para outro tubo 2 a 3 dias (30 C) Usar como antígeno no teste: 7 a 14 dias no meio

11 PREPARO DA MICROPLACA Poços da primeira linha (A) colocar o controle negativo interno do teste (antígeno = cultura de leptospira e solução salina) 20 µl Ag + 20 µl sol.

12 Linha A: colocar o Ag diluído em salina (diferentes sorovares em cada poço) 20 µl sol. salina + 20 µl do Ag CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro) A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4 B C D E F G H

13 PREPARO DO SORO A SER TESTADO Diluição do soro sempre a metade do ponto de corte da leitura do resultado. Humano ou cão domiciliado: diluição do soro adicionado à microplaca: 1: 12,5 Bovino: 1: 50 Quando se adiciona o Ag, volume final no poço da microplaca dobra, e assim, a diluição também dobra (1:25 e 1:100)

14 DILUIÇÃO DO SORO A TESTAR Primeiro faz a diluição inicial 1:5 100 µl do soro em 400 µl de solução salina Soro diluído 1:5 100 µl do soro teste 400 µl salina

15 DILUIÇÃO DO SORO A TESTAR Em seguida, faz a segunda diluição: a partir da diluição 1:5. A segunda diluição é metade do valor da diluição de leitura no teste Ex: Leitura 1:25 Diluição do soro: 1:12,5 (Humano, cão) Diluição 1:12,5 400 µl do soro diluído 1: µL salina Soro diluído 1:5

16 DILUIÇÃO DO SORO A TESTAR Segunda diluição: a partir da diluição 1:5 Leitura 1:100 Diluição do soro: 1:50 (bovino) Soro diluído 1:5 Diluição 1: µl do soro diluído 1: µl salina

17 CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro) Cada linha B até H: Soro a testar B = soro do bovino 1 C = soro do bovino A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4 B C D E F G H

18 CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro) Cada linha B até H: Soro a testar B = soro do bovino 1 C = soro do bovino A Ag 1 Ag 2 Ag 3 Ag 4 B C D E F G H Agitar a placa agitador de placa para homogeneizar Incubar em estufa a 30ºC por 1 a 3 horas

19 LEITURA DOS RESULTADOS APÓS INCUBAÇÃO Agitar a placa agitador de placas Estufa 30 C por 1 a duas horas Leitura dos resultados: microscópio de campo escuro visualizar se há aglutinação (Ag + Acs soro)

20 LEITURA DO RESULTADO EM MICROSCÓPIO DE CAMPO ESCURO Soros a testar 1ª gota controle negativo interno (sem soro) = Ag com leptospiras livres Verificar se não há aglutinação nas leptospiras do antígeno (auto-aglutinação) Comparar o controle negativo interno com os soros a testar 1 gota (3 a 5 µl) placa Objetiva de 10 x Tempo de leitura não > 1,5 hora

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22 Reação positiva para aglutinação: redução maior que 50% das leptospiras vivas (livres) Aglutinação em mais de 50% Redução da densidade do Ag = aglutinação

23 Negativo Positivo Soro (anticorpos) + antígeno (leptospiras)

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26 RESULTADO Resultado: não é o título final do soro do bovino! Informa apenas: reação positiva ou negativa (título é fixo no teste) para um sorovar Teste de triagem: indica a presença de Acs no soro, mas não necessariamente a presença da doença Soros reagentes na triagem sorologia / titulação

27 3. TESTE DA SOROAGLUTINAÇÃO MICROSCÓPICA TITULAÇÃO

28 TITULAÇÃO Testar o soro com sorovares que apresentaram reação positiva (aglutinação) no teste de triagem Usar apenas os sorovares que reagiram com o soro teste na sorologia de triagem Diluição seriada nos soros a testar (diluições dobradas) Indica a titulação real do animal/pessoa

29 TITULAÇÃO Soro humano 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800 1:1600 Soro bovino 1:100 1:200 1:400 1:800 1: : :6.400

30 MONTAGEM DA MICROPLACA

31 CONTROLE NEGATIVO INTERNO (sem soro) Em cada pocinho da primeira linha (por coluna) Antígeno ( 20µL de sol. Salina + : 20µL do Ag) = controle negativo interno A Ag 1 Ag 2 B 1:25 C 1:50 D 1:100 E 1:200 F 1:400 G 1:800 H 1:1600 Ag 3 Ag 4 Cada coluna (B até H): um soro a testar para cada sorovar (Ag) Cada linha é uma diluição do soro teste (diluições seriadas)

32 CONTROLE NEGATIVO (sem soro) Em cada pocinho da primeira linha (por coluna) Antígeno ( 20µL de sol. Salina + : 20µL do Ag) A Ag 1 Ag 2 B 1:25 C 1:50 D 1:100 E 1:200 F 1:400 G 1:800 H 1:1600 Ag 3 Ag 4 1º: Cada coluna (C até H): 20µL de sol. Salina 2º: Poço B: 40 µl do soro diluído 1:12,5 (sem salina)

33 Diluição seriada do soro teste: 20 µl soro 1:12,5 (B) Poço C (1:25) Poço D (1:50) Poço E (1:100) Poço F (1:200) Poço G (1:400) Poço H (1:800) desprezar 20 µl finais A Ag 1 Ag 2 B 1:25 C 1:50 D 1:100 E 1:200 F 1:400 G 1:800 Ag 3 Ag 4 H 1:1600 Adicionar 20 µl do Ag (cultura de sorovar de leptospira mantido em tubo de vidro com meio de cultura EMJH) em cada poço com soro dobro o volume contido no poço dobro a diluição alcança o título de leitura do soro

34 LEITURA DOS RESULTADOS Agitar a placa agitador de placas Estufa 30 C por 1 a duas horas Leitura Microscópio de campo escuro visualizar se há aglutinação (Ag + Acs soro)

35 LEITURA DO RESULTADO EM MICROSCÓPIO DE CAMPO ESCURO Soros a testar 1:25 1:100 1:400 1:1600 1:50 1:200 1:800 1ª gota controle negativo (sem soro) Cultura de leptospiras Se não há aglutinação Comparar com os soros a testar 1 gota (3 a 5 µl) placa Objetiva de 10 x ou 20X Tempo de leitura não > 1,5 hora

36 RESULTADOS Fechar diagnóstico: Clínica + Epidemiológico + Título Bovino: Aborto + Roedores/Aguada + título > 1:400 Sorovar infectante: título mais alto 2 sorovares com mesmo título: resultado positivo para os dois títulos (reação cruzada ou infecção pelo 2) Diluir mais o soro descobrir qual desses 2 sorovares é infectante (título mais alto) Ou infecção por um sorovar não existente na bateria

37 RESULTADOS Diferenciar sorovar: estudos epidemiológicos ou vacinação Para clínica não interessa: tratamento é o mesmo Título vacinal: bovino até 6 meses pós vacinação Título 1:400 Perguntar: quando foi a vacinação, para quais sorovares Sem clínica nem evidência epidemiológica = vacinal

38 RESULTADOS Título vacinal: bovino até 6 meses pós vacinação Título 1:400 Tem clínica + epidemiológico Título alto de sorovar diferente do encontrado na vacina doença

39 RESULTADOS Ideal é fazer diagnóstico sorológico populacional Amostra representativa: Animais que abortaram (3-4 dias após aborto queda imunidade sem Acs) + outras categorias Títulos altos e baixos Vaca aborto + > 1:400 infectado (não precisa novo teste) 1:100 (início ou fim infecção dias (PI: 2-14 dias, média 7 d) nova coleta soroconversão

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