IFI HIV-1 Bio-Manguinhos IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HIV-1 (material fornecido para 100 determinações)

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1 Edição: Fevereiro 09 Arte: BM_BUL_033_00_R IFI HIV-1 Bio-Manguinhos IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HIV-1 (material fornecido para 100 determinações) IFI HIV-1 Bio-Manguinhos Edição: Fevereiro 09 Arte: BM_BUL_033_00_R IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HIV-1 (material fornecido para 100 determinações)

2 IFI HIV 1 Bio-Manguinhos IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HIV-1 (material fornecido para 100 determinações) PRINCÍPIO DO TESTE Este teste consiste na reação de soros ou plasmas humanos com células K37-3, infectadas pelo vírus da imunodefi ciência humana tipo 1 (HIV-1), fi xadas em lâminas de microscopia para fl uorescência. Aproximadamente 25-35% das células possuem antígenos virais capazes de serem detectados em sua superfície. A reação entre o antígeno fixado e o anticorpo presente nas amostras é visualizada após a adição de anti-imunoglobulina humana (Ig), conjugada com isotiocianato de fluoresceína. Para a leitura da reação deve-se utilizar microscópio para fl uorescência. ESQUEMA DO TESTE Reação Positiva LUZ AZUL E ULTRAVIOLETA CÉLULAS INFECTADAS AMOSTRA POSITIVA CONJUGADO FLUORESCÊNCIA Reação Negativa LUZ AZUL E ULTRAVIOLETA CÉLULAS INFECTADAS AMOSTRA NEGATIVA CONJUGADO AUSÊNCIA DE FLUORESCÊNCIA 2 IFI HIV 1 Bio-Manguinhos IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HIV-1 (material fornecido para 100 determinações) PRINCÍPIO DO TESTE Este teste consiste na reação de soros ou plasmas humanos com células K37-3, infectadas pelo vírus da imunodefi ciência humana tipo 1 (HIV-1), fi xadas em lâminas de microscopia para fl uorescência. Aproximadamente 25-35% das células possuem antígenos virais capazes de serem detectados em sua superfície. A reação entre o antígeno fixado e o anticorpo presente nas amostras é visualizada após a adição de anti-imunoglobulina humana (Ig), conjugada com isotiocianato de fluoresceína. Para a leitura da reação deve-se utilizar microscópio para fl uorescência. ESQUEMA DO TESTE Reação Positiva LUZ AZUL E ULTRAVIOLETA CÉLULAS INFECTADAS AMOSTRA POSITIVA CONJUGADO FLUORESCÊNCIA Reação Negativa LUZ AZUL E ULTRAVIOLETA CÉLULAS INFECTADAS AMOSTRA NEGATIVA CONJUGADO AUSÊNCIA DE FLUORESCÊNCIA 2

3 ENSAIO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA HIV 1 MODELO DE PROTOCOLO Lote: Validade: IFI nº: Data: Antígeno: Lote: Validade: Conjugado: Lote: Validade: Diluição: Lâmina nº: Lâmina nº: Técnico Responsável: Observações: 18 MATERIAL FORNECIDO Componentes Apresentação Lâminas para IFI com Células K37-3 Infectadas pelo HIV-1 10 lâminas Controle Positivo 1 fr. de 0,25 ml Controle Negativo 1 fr. de 0,25 ml Anti-Ig Humana Conjugada com Fluoresceína 1 fr. de 0,15 ml Glicerina Tamponada ph 9,0 0,5 1 fr. de 2 ml Azul de Evans 0,1% 1 fr. de 0,25 ml Manual de Instrução de Uso MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO - Tampão fosfato (PBS) ph 7,2; - Microplacas e pipetadores de volume regulável ou tubos e pipetas para diluições; - Recipiente com tampa com gaze umedecida para câmara úmida; - Cubas para lavagem de lâminas (tipo Koplin); - Luvas descartáveis; - Água destilada; - Hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária; - Recipiente para descarte de material contaminado; - Lamínulas 24 x 60 mm; - Vidraria básica em geral (tubos, pipetas, provetas, etc); - Estufa a 37 o C; - Microscópio para fl uorescência. CONSERVAÇÃO E ESTOCAGEM DO MATERIAL Manter a -20 o C: Lâminas para IFI, Controle Positivo e Controle Negativo. Manter entre 2 o e 8 o C: Anti-Ig Humana, Glicerina Tamponada e Azul de Evans. Todos os componentes do teste devem ser guardados nas temperaturas indicadas desde o ato do recebimento do conjunto, permanecendo estáveis pela validade defi nida na caixa principal do kit. 3 ENSAIO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) PARA HIV 1 MODELO DE PROTOCOLO Lote: Validade: IFI nº: Data: Antígeno: Lote: Validade: Conjugado: Lote: Validade: Diluição: Lâmina nº: Lâmina nº: Técnico Responsável: Observações: 18 MATERIAL FORNECIDO Componentes Apresentação Lâminas para IFI com Células K37-3 Infectadas pelo HIV-1 10 lâminas Controle Positivo 1 fr. de 0,25 ml Controle Negativo 1 fr. de 0,25 ml Anti-Ig Humana Conjugada com Fluoresceína 1 fr. de 0,15 ml Glicerina Tamponada ph 9,0 0,5 1 fr. de 2 ml Azul de Evans 0,1% 1 fr. de 0,25 ml Manual de Instrução de Uso MATERIAL NECESSÁRIO MAS NÃO FORNECIDO - Tampão fosfato (PBS) ph 7,2; - Microplacas e pipetadores de volume regulável ou tubos e pipetas para diluições; - Recipiente com tampa com gaze umedecida para câmara úmida; - Cubas para lavagem de lâminas (tipo Koplin); - Luvas descartáveis; - Água destilada; - Hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária; - Recipiente para descarte de material contaminado; - Lamínulas 24 x 60 mm; - Vidraria básica em geral (tubos, pipetas, provetas, etc); - Estufa a 37 o C; - Microscópio para fl uorescência. CONSERVAÇÃO E ESTOCAGEM DO MATERIAL Manter a -20 o C: Lâminas para IFI, Controle Positivo e Controle Negativo. Manter entre 2 o e 8 o C: Anti-Ig Humana, Glicerina Tamponada e Azul de Evans. Todos os componentes do teste devem ser guardados nas temperaturas indicadas desde o ato do recebimento do conjunto, permanecendo estáveis pela validade defi nida na caixa principal do kit. 3

4 Obs.: A temperatura de transporte, com bobinas de gelo reciclável, permite que o conjunto se mantenha em condições adequadas durante 24 a 36 horas. CUIDADOS E PRECAUÇÕES Somente para uso in vitro. Este conjunto diagnóstico contém produtos biológicos e químicos, podendo representar uma fonte de infecção. Portanto, ao manusear qualquer um dos reagentes desse conjunto, observar as precauções de biossegurança necessárias. A qualidade dos resultados obtidos com este conjunto diagnóstico depende do cumprimento às boas práticas de laboratório, tais como: -As amostras, assim como lâminas e outros insumos devem ser estocados e manipulados adequadamente; -Homogeneizar as amostras e controles antes de usar; -Utilizar equipamento de proteção individual (EPI), tais como luvas descartáveis, jaleco e protetor facial em todas as etapas do teste; -Desprezar ponteiras, luvas, pipetas de vidro, frascos, lâminas usadas, etc., em solução de hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária; -Para evitar interferências,nunca tocar com os dedos na parte superior da lâmina onde se encontram as células fi xadas; -Nunca reaproveitar as lâminas; -Não usar os reativos após sua data de validade; -Utilizar frascos e vidrarias rigorosamente limpos, secos e desengordurados, pois resíduos de detergentes e/ou substâncias oxidantes poderão interferir na reação; -Nunca misturar componentes de lotes diferentes; -Utilizar lápis grafi te preto para identifi car e / ou numerar lâminas escrevendo unicamente o necessário e qualquer anotação deve ser registrada no protocolo do ensaio. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Ascher, M. S. & Wilber, J. C. Immunofluorescence for Serodiagnosis of Retrovirus Infection. Arch. Pathol. Lab. Med. 114: , Gallo, D.; Hoffman, M. N.; Yeh, E.T.; George, J. G. & Hanson, C. V. Comparison of Indirect Immunofluorescence and Membrane Fluorescence Assays for the Diferentiation of Antibodies to Human Immunodeficiency Virus Types 1 and 2. J. Clin. Microbiol. 30: , Sullivan, M. T.; Mucke, H.; Kadey, S. D.; Fang, C. T. & Williams, A. E. Evaluation od an Indirect Immunofluorescence Assay for Confirmation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Antibody in U.S. Blood Donor Sera. J. Clin. Microbiol., 30: , Sandstrom, E. G.; Schooley, R. T.; Ho, D. D.; Byington, R.; Sarngadharan, M. G.; MacLaren, M. E.; Essex, E.; Gallo, R. C. & Hirsch, M. S. Detection of Human anti-htlv-iii Antibodies by Indirect Immunofluorescence Using Fixed Cells. Transfusion, 25/41: , ASSISTÊNCIA AOS USUÁRIOS Orientações técnicas adicionais a respeito deste produto poderão ser obtidas junto a: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos Bio-Manguinhos Fiocruz CNPJ: / Av. Brasil, Manguinhos -CEP: Rio de Janeiro - RJ SAC: ocruz.br Fax: (21) ocruz.br 4 17 Obs.: A temperatura de transporte, com bobinas de gelo reciclável, permite que o conjunto se mantenha em condições adequadas durante 24 a 36 horas. CUIDADOS E PRECAUÇÕES Somente para uso in vitro. Este conjunto diagnóstico contém produtos biológicos e químicos, podendo representar uma fonte de infecção. Portanto, ao manusear qualquer um dos reagentes desse conjunto, observar as precauções de biossegurança necessárias. A qualidade dos resultados obtidos com este conjunto diagnóstico depende do cumprimento às boas práticas de laboratório, tais como: -As amostras, assim como lâminas e outros insumos devem ser estocados e manipulados adequadamente; -Homogeneizar as amostras e controles antes de usar; -Utilizar equipamento de proteção individual (EPI), tais como luvas descartáveis, jaleco e protetor facial em todas as etapas do teste; -Desprezar ponteiras, luvas, pipetas de vidro, frascos, lâminas usadas, etc., em solução de hipoclorito de sódio a 2,5% ou água sanitária; -Para evitar interferências,nunca tocar com os dedos na parte superior da lâmina onde se encontram as células fi xadas; -Nunca reaproveitar as lâminas; -Não usar os reativos após sua data de validade; -Utilizar frascos e vidrarias rigorosamente limpos, secos e desengordurados, pois resíduos de detergentes e/ou substâncias oxidantes poderão interferir na reação; -Nunca misturar componentes de lotes diferentes; -Utilizar lápis grafi te preto para identifi car e / ou numerar lâminas escrevendo unicamente o necessário e qualquer anotação deve ser registrada no protocolo do ensaio. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. Ascher, M. S. & Wilber, J. C. Immunofluorescence for Serodiagnosis of Retrovirus Infection. Arch. Pathol. Lab. Med. 114: , Gallo, D.; Hoffman, M. N.; Yeh, E.T.; George, J. G. & Hanson, C. V. Comparison of Indirect Immunofluorescence and Membrane Fluorescence Assays for the Diferentiation of Antibodies to Human Immunodeficiency Virus Types 1 and 2. J. Clin. Microbiol. 30: , Sullivan, M. T.; Mucke, H.; Kadey, S. D.; Fang, C. T. & Williams, A. E. Evaluation od an Indirect Immunofluorescence Assay for Confirmation of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Antibody in U.S. Blood Donor Sera. J. Clin. Microbiol., 30: , Sandstrom, E. G.; Schooley, R. T.; Ho, D. D.; Byington, R.; Sarngadharan, M. G.; MacLaren, M. E.; Essex, E.; Gallo, R. C. & Hirsch, M. S. Detection of Human anti-htlv-iii Antibodies by Indirect Immunofluorescence Using Fixed Cells. Transfusion, 25/41: , ASSISTÊNCIA AOS USUÁRIOS Orientações técnicas adicionais a respeito deste produto poderão ser obtidas junto a: Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos Bio-Manguinhos Fiocruz CNPJ: / Av. Brasil, Manguinhos -CEP: Rio de Janeiro - RJ SAC: ocruz.br Fax: (21) ocruz.br 4 17

5 ÍNDICES DE SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE A sensibilidade e especificidade de 100% levaram em consideração os resultados obtidos de amostras avaliadas através de ensaios enzimáticos de princípios metodológicos ou composição antigênica diferentes. Destas amostras, 20% ainda foram confi rmadas pela metodologia de Western Blot, que é considerada Gold Standart para diagnostico de HIV, que foram confrontadas com o IFI HIV-1. REPRODUTIBILIDADE, REPETITIVIDADE E ESTABILIDADE Diversos estudos foram realizados em nossos laboratórios, avaliando amostras conhecidas e caracterizadas como padrão, sob os aspectos de reprodutibilidade e repetitividade. As conclusões nos permitem determinar um período de 01 ano de validade para o produto, se acondicionado conforme as recomendações do Manual de Instruções de Uso, mantendo-se as mesmas características e padrões de qualidade. PREPARO DO TAMPÃO FOSFATO ph 7,2 (PBS) Sais Cloreto de Sódio (NaCl) PA 0,145M Fosfato de Sódio Dibásico Anidro (Na 2 HPO 4 ) PA 0,00772M Fosfato de Sódio Monobásico Anidro (NaH 2 PO 4 ) PA 0,00228M Água destilada q.s.p. (quantidade sufi ciente para) Quantidade 8,77 g 1,02 g 0,34 g 1000 ml ATENÇÃO:Os sais descritos acima, quando não utilizados na forma anidra, deverão ter suas quantidades recalculadas em função das moléculas de água presentes. Verifi car sempre no rótulo dos produtos a composição dos sais e o peso molecular. Exemplo de correção de peso para preparo de PBS quando se utilizar o fosfato dibásico hidratado com 12 moléculas de água. Cálculo: Na 2 HPO 4 Anidro - Peso Molecular = 142 Na 2 HPO 4.12H 2 O - Peso Molecular = ,02 X = 1,02 x 358 = 2,57 g X 142 pesar 1,02 g pesar X g Neste exemplo, onde o Fosfato Dibásico é hidratado com 12 moléculas de água, deve-se pesar 2,57 g para preparar o PBS. TITULAÇÃO DO CONJUGADO O título do conjugado varia em função das condições de trabalho, do microscópio utilizado e do operador. O laboratório deverá utilizar o controle negativo na diluição 1:8, e o controle positivo para HIV-1, com título conhecido, descrito no rótulo, que será utilizado nas diluição 1:8 e na diluição correspondente a seu título ÍNDICES DE SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE A sensibilidade e especificidade de 100% levaram em consideração os resultados obtidos de amostras avaliadas através de ensaios enzimáticos de princípios metodológicos ou composição antigênica diferentes. Destas amostras, 20% ainda foram confi rmadas pela metodologia de Western Blot, que é considerada Gold Standart para diagnostico de HIV, que foram confrontadas com o IFI-HIV 1. REPRODUTIBILIDADE, REPETITIVIDADE E ESTABILIDADE Diversos estudos foram realizados em nossos laboratórios, avaliando amostras conhecidas e caracterizadas como padrão, sob os aspectos de reprodutibilidade e repetitividade. As conclusões nos permitem determinar um período de 01 ano de validade para o produto, se acondicionado conforme as recomendações do Manual de Instruções de Uso, mantendo-se as mesmas características e padrões de qualidade. PREPARO DO TAMPÃO FOSFATO ph 7,2 (PBS) Sais Quantidade Cloreto de Sódio (NaCl) PA 0,145M 8,77 g Fosfato de Sódio Dibásico Anidro (Na2 HPO ) 4 PA 0,00772M 1,02 g Fosfato de Sódio Monobásico Anidro (NaH2 PO ) 4 PA 0,00228M 0,34 g Água destilada q.s.p. (quantidade sufi ciente para) 1000 ml ATENÇÃO:Os sais descritos acima, quando não utilizados na forma anidra, deverão ter suas quantidades recalculadas em função das moléculas de água presentes. Verifi car sempre no rótulo dos produtos a composição dos sais e o peso molecular. Exemplo de correção de peso para preparo de PBS quando se utilizar o fosfato dibásico hidratado com 12 moléculas de água. Cálculo: Na2 HPO Anidro - Peso Molecular = 142 pesar 1,02 g 4 Na2 HPO.12H O - Peso Molecular = 358 pesar X g ,02 X = 1,02 x 358 = 2,57 g X 142 Neste exemplo, onde o Fosfato Dibásico é hidratado com 12 moléculas de água, deve-se pesar 2,57 g para preparar o PBS. TITULAÇÃO DO CONJUGADO O título do conjugado varia em função das condições de trabalho, do microscópio utilizado e do operador. O laboratório deverá utilizar o controle negativo na diluição 1:8, e o controle positivo para HIV-1, com título conhecido, descrito no rótulo, que será utilizado nas diluição 1:8 e na diluição correspondente a seu título. 16 5

6 1. Retirar da refrigeração: a) duas lâminas, e colocá-las por 10 minutos a 37 C em estufa para secagem. Evitar atrito com a parte superior das lâminas onde se encontram as células fi xadas; b) os controles positivo e negativo e os demais reagentes deverão estar à temperatura ambiente para sua utilização. 2. Fazer um protocolo de trabalho, indicando a posição do controle positivo (CP), do controle negativo (CN), e controle do conjugado (PBS), conforme a seguir: INDETERMINADO Qualquer padrão diferente dos descritos anteriormente. Na maioria das vezes, observa-se reação fl uorescente em todas as células. Neste caso, repita a reação e, persistindo o resultado, submeta a amostra a outra metodologia confi rmatória. CP* título: Diluição referente ao título para HIV-1 3. Diluir o controle negativo (CN) 1:8 em PBS. Para realizar esta diluição, utilizar 25 µl de soro e adicionar 175 µl de PBS. Homogeneizar suavemente, evitando a formação de bolhas. 4. Diluir o controle positivo (CP), utilizando o esquema de diluição seriada a seguir: CONSIDERAÇÕES A síndrome da imunodefi ciência humana adquirida (AIDS), é um grave problema em saúde pública. Esta síndrome caracteriza-se pela diminuição das células envolvidas na indução de resposta imune, por infecções oportunistas múltiplas, neoplasias, além do comprometimento neurológico. A AIDS é uma sindrome na qual ocorre simultaneamente ausência de regulação, disfunção e defi ciências imunológicas. Dentre as ações de prevenção e controle desta síndrome, o diagnóstico sorológico vem tornando-se um instrumento indispensável. Ao longo dos anos, observa-se o aumento do número de laboratórios que utilizam a metodologia de IFI como alternativa de confirmação sorológica, reduzindo a necessidade de utilização da metodologia de Western Blot, que é um ensaio de alto custo. ATENÇÃO: Homogeneizar o conteúdo de cada tubo antes de transferir o volume de 200 µl para o tubo seguinte Retirar da refrigeração: a) duas lâminas, e colocá-las por 10 minutos a 37 C em estufa para secagem. Evitar atrito com a parte superior das lâminas onde se encontram as células fi xadas; b) os controles positivo e negativo e os demais reagentes deverão estar à temperatura ambiente para sua utilização. INDETERMINADO Qualquer padrão diferente dos descritos anteriormente. Na maioria das vezes, observa-se reação fl uorescente em todas as células. Neste caso, repita a reação e, persistindo o resultado, submeta a amostra a outra metodologia confi rmatória. 2. Fazer um protocolo de trabalho, indicando a posição do controle positivo (CP), do controle negativo (CN), e controle do conjugado (PBS), conforme a seguir: CONSIDERAÇÕES CP* título: Diluição referente ao título para HIV-1 3. Diluir o controle negativo (CN) 1:8 em PBS. Para realizar esta diluição, utilizar 25 µl de soro e adicionar 175 µl de PBS. Homogeneizar suavemente, evitando a formação de bolhas. A síndrome da imunodefi ciência humana adquirida (AIDS), é um grave problema em saúde pública. Esta síndrome caracteriza-se pela diminuição das células envolvidas na indução de resposta imune, por infecções oportunistas múltiplas, neoplasias, além do comprometimento neurológico. A AIDS é uma sindrome na qual ocorre simultaneamente ausência de regulação, disfunção e defi ciências imunológicas. Dentre as ações de prevenção e controle desta síndrome, o diagnóstico sorológico vem tornando-se um instrumento indispensável. Ao longo dos anos, observa-se o aumento do número de laboratórios que utilizam a metodologia de IFI como alternativa de confirmação sorológica, reduzindo a necessidade de utilização da metodologia de Western Blot, que é um ensaio de alto custo. 4. Diluir o controle positivo (CP), utilizando o esquema de diluição seriada a seguir: ATENÇÃO: Homogeneizar o conteúdo de cada tubo antes de transferir o volume de 200 µl para o tubo seguinte. 6 15

7 REAGENTE Cerca de 25-35% das células apresentam fl uorescência na membrana e em parte da célula. Algumas amostras podem apresentar reatividade pouco intensa, porém sempre que observada a fl uorescência no percentual indicado, a amostra será reagente. 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl TUBO 1 Diluição 1:8 350 µl de PBS 50 µl de soro TUBO 2 Diluição 1:16 diluição 1:8 TUBO 3 Diluição 1:32 diluição 1:16 TUBO 4 Diluição 1:64 diluição 1:32 TUBO 5 Diluição 1:128 diluição 1:64 TUBO 6 Diluição 1:256 diluição 1: Conforme seu protocolo de trabalho (item 2), adicionar 10 µl das diluições nos poços correspondentes ao controle negativo (diluído 1:8), controle positivo (diluído 1:8), controle positivo (diluição equivalente ao título para HIV-1 descrito no rótulo do frasco), e PBS. ATENÇÃO: O título para HIV-1 do controle positivo (CP) está descrito no rótulo do frasco. NÃO REAGENTE Ausência de fl uorescência em todas as células IFI HIV-1 Bio-Manguinhos Controle Positivo Título 1:256 (HIV-1) VS/MS: Lote: ---- Val: ---- Vol: Cons: Neste exemplo, utilizaríamos a diluição 1:256. ATENÇÃO: Evitar que a ponta da ponteira toque ou raspe a superfície da lâmina, pois este procedimento provocará a retirada das células. Tomar cuidado para que o conteúdo de diferentes poços não se misturem. Utilizar uma ponteira para cada amostra ou controle a ser utilizado REAGENTE Cerca de 25-35% das células apresentam fl uorescência na membrana e em parte da célula. Algumas amostras podem apresentar reatividade pouco intensa, porém sempre que observada a fl uorescência no percentual indicado, a amostra será reagente. 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl 200 µl TUBO 1 Diluição 1:8 350 µl de PBS 50 µl de soro TUBO 2 Diluição 1:16 diluição 1:8 TUBO 3 Diluição 1:32 diluição 1:16 TUBO 4 Diluição 1:64 diluição 1:32 TUBO 5 Diluição 1:128 diluição 1:64 TUBO 6 Diluição 1:256 diluição 1: Conforme seu protocolo de trabalho (item 2), adicionar 10 µl das diluições nos poços correspondentes ao controle negativo (diluído 1:8), controle positivo (diluído 1:8), controle positivo (diluição equivalente ao título para HIV-1 descrito no rótulo do frasco), e PBS. ATENÇÃO: O título para HIV-1 do controle positivo (CP) está descrito no rótulo do frasco. NÃO REAGENTE Ausência de fl uorescência em todas as células IFI HIV-1 Bio-Manguinhos Controle Positivo Título 1:256 (HIV-1) VS/MS: Lote: ---- Val: ---- Vol: Cons: Neste exemplo, utilizaríamos a diluição 1:256. ATENÇÃO: Evitar que a ponta da ponteira toque ou raspe a superfície da lâmina, pois este procedimento provocará a retirada das células. Tomar cuidado para que o conteúdo de diferentes poços não se misturem. Utilizar uma ponteira para cada amostra ou controle a ser utilizado. 14 7

8 6. Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C, em estufa. A câmara úmida deve ser previamente colocada em estufa a 37 C por 30 minutos, para estabilizar na mesma temperatura de incubação do teste. Checar a umidade e repetir este procedimento em todas as etapas de incubação. 7. Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 8. Colocar as lâminas por 10 minutos a 37 C em estufa para secagem. 9. Preparar uma solução de PBS-Azul de Evans (PBS-AE), a 0,004%. Colocar em um tubo 100 µl de Azul de Evans 0,1% e 2400 µl de PBS. 10. Diluir o conjugado anti-ig humana marcada com fl uoresceína, conforme descrito a seguir: LEITURA E INTERPRETAÇÃO: 1- Para a leitura e interpretação das reações utilizar o microscópio de imunofl uorescência e objetiva de 40X. Focalizar a lâmina na posição do controle positivo e observar a fl uorescência presente em cerca de 25-35% das células, de acordo com o padrão descrito a seguir. Obs.: em algumas preparações de lâminas, a presença de grumos de células poderão ser observados no centro dos orifícios. Neste caso, para facilitar a interpretação do teste, recomendamos que a leitura seja realizada em campos mais periféricos, onde não são observadas aglomerações de células. 2- Focalizar a lâmina na posição do controle negativo e observar a ausência de fl uorescência nas células, bem como a coloração de fundo ( background ). 10 µl de Conjugado 490 µl PBS-AE 3- Proceder a leitura de cada amostra em no mínimo cinco diferentes campos, em um mesmo poço, considerando os padrões descritos a seguir: TUBO 1 Diluição 1: µl PBS-AE TUBO 2 Diluição 1: µl PBS-AE TUBO 3 Diluição 1: µl PBS-AE TUBO 4 Diluição 1: µl PBS-AE TUBO 5 Diluição 1: µl PBS-AE TUBO 6 Diluição 1: µl PBS-AE Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C, em estufa. A câmara úmida deve ser previamente colocada em estufa a 37 C por 30 minutos, para estabilizar na mesma temperatura de incubação do teste. Checar a umidade e repetir este procedimento em todas as etapas de incubação. 7. Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 8. Colocar as lâminas por 10 minutos a 37 C em estufa para secagem. 9. Preparar uma solução de PBS-Azul de Evans (PBS-AE), a 0,004%. Colocar em um tubo 100 µl de Azul de Evans 0,1% e 2400 µl de PBS. 10. Diluir o conjugado anti-ig humana marcada com fl uoresceína, conforme descrito a seguir: LEITURA E INTERPRETAÇÃO: 1- Para a leitura e interpretação das reações utilizar o microscópio de imunofl uorescência e objetiva de 40X. Focalizar a lâmina na posição do controle positivo e observar a fl uorescência presente em cerca de 25-35% das células, de acordo com o padrão descrito a seguir. Obs.: em algumas preparações de lâminas, a presença de grumos de células poderão ser observados no centro dos orifícios. Neste caso, para facilitar a interpretação do teste, recomendamos que a leitura seja realizada em campos mais periféricos, onde não são observadas aglomerações de células. 2- Focalizar a lâmina na posição do controle negativo e observar a ausência de fl uorescência nas células, bem como a coloração de fundo ( background ). 10 µl de Conjugado 490 µl PBS-AE 3- Proceder a leitura de cada amostra em no mínimo cinco diferentes campos, em um mesmo poço, considerando os padrões descritos a seguir: TUBO 1 Diluição 1: µl PBS-AE TUBO 2 Diluição 1: µl PBS-AE TUBO 3 Diluição 1: µl PBS-AE TUBO 4 Diluição 1: µl PBS-AE TUBO 5 Diluição 1: µl PBS-AE TUBO 6 Diluição 1: µl PBS-AE 8 13

9 9- Diluir o conjugado ant-ig humana - fl uoresceína na proporção adequada obtida com a prévia titulação do conjugado, em PBS-AE conforme esquema abaixo: 11- Adicionar 15 µl das diluições do conjugado em cada poço,conforme esquema a seguir: Nº Lâminas Título Conjugado PBSAE PBSAEConjugado 12 1 à 2 1:100 5 µl 495 µl 500 µl 1 à 5 1:200 5 µl 995 µl 1000 µl 1 à 8 1:300 5 µl 1495 µl 1500 µl 1 à 11 1:400 5 µl 1995 µl 2000 µl 1 à 12 1:500 5 µl 2495 µl 2500 µl 1 à 12 1:600 5 µl 2995 µl 3000 µl 1 à 12 1:700 5 µl 3495 µl 3500 µl 1 à 12 1:800 5 µl 3995 µl 4000 µl 1 à 12 1:900 5 µl 4495 µl 4500 µl 10- Adicionar 15 µl da diluição do conjugado em todos os poços das lâminas. 11- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C, em estufa. 12- Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, vez em água destilada. 13- Colocar as lâminas por 10 minutos a 37 C em estufa para secagem Adicionar 1 gota de glicerina tamponada em cada orifício da lâmina, cobrindo-a com lamínula, evitando a formação de bolhas. Mantê-la sob abrigo da luz e a seco até o momento da leitura. 12- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C, em estufa. 13- Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 14- Colocar as lâminas por 10 minutos a 37 C em estufa para secagem Adicionar 1 gota de glicerina tamponada em cada orifício da lâmina, cobrindo-a com lamínula, evitando a formação de bolhas. Mantê-las sob abrigo da luz e a seco até o momento da leitura. DEFINIÇÃO DO TÍTULO DO CONJUGADO: Para a leitura das reações e defi nição da diluição de uso do conjugado, utilizar o microscópio de imunofl uorescência e objetiva com aumento de 40X. O título do conjugado corresponderá à primeira diluição em que se observar fl uorescência intensa no controle positivo diluído (1:8), e fl uorescência fraca no controle positivo na diluição correspondente ao título para HIV-1. Além disso, deve-se observar também ausência de fl uorescência no controle negativo e no PBS (controle de conjugado). Caso não seja possível defi nir o titulo entre as diluições utilizadas inicialmente, deve-se proceder uma nova série de titulações, utilizando-se mais uma lâmina. Esta nova série de titulações deverá ser iniciada a partir da concentração 1:700 até a diluição 1: Diluir o conjugado ant-ig humana - fl uoresceína na proporção adequada obtida com a prévia titulação do conjugado, em PBS-AE conforme esquema abaixo: 11- Adicionar 15 µl das diluições do conjugado em cada poço,conforme esquema a seguir: Nº Lâminas Título Conjugado PBSAE PBSAEConjugado 1 à 2 1:100 5 µl 495 µl 500 µl 1 à 5 1:200 5 µl 995 µl 1000 µl 1 à 8 1:300 5 µl 1495 µl 1500 µl 1 à 11 1:400 5 µl 1995 µl 2000 µl 1 à 12 1:500 5 µl 2495 µl 2500 µl 1 à 12 1:600 5 µl 2995 µl 3000 µl 1 à 12 1:700 5 µl 3495 µl 3500 µl 12 1 à 12 1:800 5 µl 3995 µl 4000 µl 1 à 12 1:900 5 µl 4495 µl 4500 µl 10- Adicionar 15 µl da diluição do conjugado em todos os poços das lâminas. 11- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C, em estufa. 12- Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, vez em água destilada. 13- Colocar as lâminas por 10 minutos a 37 C em estufa para secagem Adicionar 1 gota de glicerina tamponada em cada orifício da lâmina, cobrindo-a com lamínula, evitando a formação de bolhas. Mantê-la sob abrigo da luz e a seco até o momento da leitura. 12- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C, em estufa. 13- Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 14- Colocar as lâminas por 10 minutos a 37 C em estufa para secagem Adicionar 1 gota de glicerina tamponada em cada orifício da lâmina, cobrindo-a com lamínula, evitando a formação de bolhas. Mantê-las sob abrigo da luz e a seco até o momento da leitura. DEFINIÇÃO DO TÍTULO DO CONJUGADO: Para a leitura das reações e defi nição da diluição de uso do conjugado, utilizar o microscópio de imunofl uorescência e objetiva com aumento de 40X. O título do conjugado corresponderá à primeira diluição em que se observar fl uorescência intensa no controle positivo diluído (1:8), e fl uorescência fraca no controle positivo na diluição correspondente ao título para HIV-1. Além disso, deve-se observar também ausência de fl uorescência no controle negativo e no PBS (controle de conjugado). Caso não seja possível defi nir o titulo entre as diluições utilizadas inicialmente, deve-se proceder uma nova série de titulações, utilizando-se mais uma lâmina. Esta nova série de titulações deverá ser iniciada a partir da concentração 1:700 até a diluição 1:900. 9

10 ATENÇÃO: não esquecer que nos poços correspondentes ao controle positivo, somente 25-35% das células possuem antígenos virais capazes de serem detectados. PROCEDIMENTO DO TESTE 1- Fazer o protocolo de trabalho (vide modelo em anexo), podendo avaliar até 10 amostras de soro ou plasma por lâmina. ATENÇÃO: os controles positivo e negativo devem estar presentes em todas as lâminas para comparações no momento da leitura. 2- Retirar da refrigeração as lâminas necessárias para testar as amostras, e colocá-las por 10 minutos a 37 C em estufa para secagem. Os controles positivo e negativo, e os demais reagentes, deverão estar à temperatura ambiente para sua utilização. ATENÇÃO: evitar atrito com a parte superior da lâmina onde se encontram as células fi xadas. 3- Diluir as amostras a serem testadas e os controles positivo e negativo 1:8 em PBS. Para realizar essa diluição utilizar 20 µl de soro ou plasma e adicionar 140 µl de PBS. Homogeneizar suavemente, evitando a formação de bolhas. 4- Adicionar 10 µl das diluições das amostras e controles positivo e negativo em cada poço das lâminas, seguindo o modelo abaixo e seu protocolo de trabalho. A = Amostra ATENÇÃO: Evitar que a ponta da ponteira toque ou raspe a superfície da lâmina, pois este procedimento provocará a retirada das células. Tomar cuidado para que o conteúdo de diferentes poços não se misturem. Utilizar uma ponteira para cada amostra ou controle a ser aplicado na lâmina. 5- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C, em estufa. 6- Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 7- Colocar as lâminas por 10 minutos a 37 C em estufa para secagem. 8- Preparar, momentos antes do uso, uma solução PBS Azul de Evans (PBS-AE), conforme tabela abaixo: O volume preparado do PBS Azul de Evans da tabela abaixo é sufi ciente para preparo de uma lâmina. Sendo utilizada tanto na diluição base quanto na diluição do conjugado, no titulo previamente defi nido. Título PBS AE PBSAE 1: µl 20 µl 500 µl 1: µl 40 µl 1000 µl 1: µl 60 µl 1500 µl 1: µl 80 µl 2000 µl 1: µl 100 µl 2500 µl 1: µl 120 µl 3000 µl 1: µl 160 µl 3500 µl 1: µl 200 µl 4000 µl 1: µl 220 µl 4500 µl ATENÇÃO: não esquecer que nos poços correspondentes ao controle positivo, somente 25-35% das células possuem antígenos virais capazes de serem detectados. PROCEDIMENTO DO TESTE 1- Fazer o protocolo de trabalho (vide modelo em anexo), podendo avaliar até 10 amostras de soro ou plasma por lâmina. ATENÇÃO: os controles positivo e negativo devem estar presentes em todas as lâminas para comparações no momento da leitura. 2- Retirar da refrigeração as lâminas necessárias para testar as amostras, e colocá-las por 10 minutos a 37 C em estufa para secagem. Os controles positivo e negativo, e os demais reagentes, deverão estar à temperatura ambiente para sua utilização. ATENÇÃO: evitar atrito com a parte superior da lâmina onde se encontram as células fi xadas. 3- Diluir as amostras a serem testadas e os controles positivo e negativo 1:8 em PBS. Para realizar essa diluição utilizar 20 µl de soro ou plasma e adicionar 140 µl de PBS. Homogeneizar suavemente, evitando a formação de bolhas. 4- Adicionar 10 µl das diluições das amostras e controles positivo e negativo em cada poço das lâminas, seguindo o modelo abaixo e seu protocolo de trabalho. ATENÇÃO: Evitar que a ponta da ponteira toque ou raspe a superfície da lâmina, pois este procedimento provocará a retirada das células. Tomar cuidado para que o conteúdo de diferentes poços não se misturem. Utilizar uma ponteira para cada amostra ou controle a ser aplicado na lâmina. 5- Incubar as lâminas em câmara úmida por 30 minutos a 37 C, em estufa. 6- Lavar as lâminas 3 (três) vezes com PBS em cuba de lavagem apropriada, 7- Colocar as lâminas por 10 minutos a 37 C em estufa para secagem. 8- Preparar, momentos antes do uso, uma solução PBS Azul de Evans (PBS-AE), conforme tabela abaixo: O volume preparado do PBS Azul de Evans da tabela abaixo é sufi ciente para preparo de uma lâmina. Sendo utilizada tanto na diluição base quanto na diluição do conjugado, no titulo previamente defi nido. Título PBS AE PBSAE 1: µl 20 µl 500 µl 1: µl 40 µl 1000 µl 1: µl 60 µl 1500 µl 1: µl 80 µl 2000 µl 1: µl 100 µl 2500 µl 1: µl 120 µl 3000 µl A = Amostra 1: µl 160 µl 3500 µl 1: µl 200 µl 4000 µl 1: µl 220 µl 4500 µl 10 11

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