HIV 1&2 BiSpot. Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Procedimento. Figura 1. Princípio do teste 432/B4 1

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1 B ligarão especificamente aos peptídios sintéticos nos pontos inferior e/ou intermediário nos dentes do pente (Figura 1). Simultaneamente, as imunoglobulinas presentes nas amostras serão capturadas pelos anticorpos anti-imunoglobulinas humanas no ponto superior (Controle Interno). Os componentes não-ligados são lavados na fileira B. Na fileira C, as IgG capturadas nos dentes reagirão com os anticorpos anti-igg humano marcados com fosfatase alcalina (FA). Nas próximas duas fileiras, os componentes que não se ligaram serão removidos por lavagem. Na fileira F, a fosfatase alcalina ligada reage com componentes cromogênicos. Os resultados são visualizados como pontos cinza-azulados na superfície dos dentes do pente. HIV 1&2 BiSpot anticorpo Formaçao do complexo peptídeo Ligação do conjugado FA FA IgG anti humano; 10 min Conjugado anti-humana FA HIV-anticorpo; 10 min Reação enzimática cor; 10 min Substrato cromogên Figura 1. Princípio do teste Código: Formato: 3 x 12 testes Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Procedimento O kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 BiSpot é um teste rápido para a determinação qualitativa e diferencial de anticorpos IgG do vírus da imunodeficiência humana tipos 1 e 2 (HIV-1 e HIV-2) em soro ou plasma humanos. Podem ser realizados 36 testes por kit. Introdução O vírus da imunodeficiência humana (HIV) é um retrovírus, identificado em 1983 como o agente etiológico da síndrome de imunodeficiência adquirida (AIDS). Podem ser diferenciados os dois subtipos HIV-1 e HIV-2. As principais vias de transmissão do HIV são contato sexual, contaminação por sangue ou derivados, e transmissão materno-neonatal. As principais células infectadas por HIV são os linfócitos CD4, que têm função essencial no sistema imunológico de defesa do organismo. A diminuição progressiva do nível de CD4 durante o desenvolvimento da doença causa infecções oportunistas com conseqüências fatais. O vírus HIV consiste de uma molécula de RNA genômica, protegida por um capsídeo e um envelope, que é o principal alvo para a reação humoral aos antibióticos. O diagnóstico sorológico da infecção pelo HIV é baseado na detecção específica de anticorpos de HIV para as proteínas do envelope viral. Princípio do teste O teste ImmunoComb II HIV 1 & 2 BiSpot é um imunoensaio enzimático indireto (EIA) em fase sólida. A fase sólida é um pente com 12 projeções ( dentes ). Cada dente é sensibilizado em três posições: ponto superior anticorpos de cabra para imunoglobulina humana (controle interno) ponto intermediário peptídios sintéticos do HIV-2 ponto inferior peptídios sintéticos do HIV-1. A Placa Reveladora possui 6 carreiras com 12 cavidades, cada fileira contendo uma solução reagente pronta para o uso nas diferentes etapas do ensaio. O teste é realizado por etapas, movendo-se o pente de uma fileira a outra, fazendo-se incubação em cada etapa. Ao início do teste, as amostras de soro ou plasma são adicionadas ao diluente nas cavidades da fileira A da Placa Reveladora. O pente é então inserido nas cavidades da fileira A. Os anticorpos de HIV eventualmente presentes nas amostras se O kit inclui um controle positivo (contendo anticorpos de HIV-1 e HIV-2) e um controle negativo (negativo para anticorpos de HIV), para serem usados em cada leitura do ensaio, para confirmação da validade do teste. Ao término da leitura, o dente usado como controle positivo deve apresentar três pontos cinza-azulados. O dente usado como controle negativo deve apresentar somente o ponto superior, que deve aparecer também em todos os outros dentes para confirmação da adição das amostras. Composição do kit Pentes O kit contém 3 pentes plásticos. Cada um possui 12 dentes, um dente para cada teste. Cada dente é sensibilizado com três regiões reativas: ponto superior: anticorpos de cabra para imunoglobulina humana (controle interno). ponto intermediário: peptídios sintéticos HIV-2 (derivados da glicoproteína env gp36) ponto inferior: peptídios sintéticos HIV-1 (derivados da glicoproteína env gp41 e gp120). ImmunoComb II Figura 2. Pente Controle interno Peptídeos HIV-2 Peptídeos HIV-1 Os pentes são fornecidos em embalagens de alumínio contendo um dessecante. Placas Reveladoras O kit contém 3 Placas Reveladoras. Cada uma contém todos os reagentes necessários para o teste. A placa reveladora consiste de 6 fileiras (A-F) com 12 cavidades cada. O conteúdo de cada fileira é o seguinte: Fileira A Fileira B Fileira C Fileira D Fileira E Fileira F Diluente de amostra Solução de lavagem Anticorpos de cabra anti-igg humano, marcados com fosfatase alcalina Anticorpos de cabra anti-igg humano, marcados com fosfatase alcalina Solução de lavagem Solução substrato cromogênico contendo 5-bromo- 4-cloro-3-indolil fosfato (BCIP) e azul de nitrotetrazolium (NBT) 432/B4 1

2 Figura 3. Placa Reveladora Controle positivo 1 frasco (tampa vermelha) de 1 ml de plasma humano diluído, positivo para anticorpos anti-hiv-1 e anti HIV-2, inativado pela adição de β-propiolactona e pelo calor. Controle negativo 1 frasco (tampa verde) de 1 ml de plasma humano inativado pelo calor, negativo para anticorpos de HIV. Perfurador para perfurar a cobertura metálica de alumínio que cobre as cavidades da placa reveladora. Segurança e Precauções Embora tenha sido inativado, trabalhar o controle positivo como potencialmente infeccioso. Todos os materiais de origem humana usados na preparação do kit foram testados e considerados não reativos para antígeno de superfície da hepatite B, anticorpos para hepatite C e anticorpos para HIV. Como nenhum teste pode garantir completamente a ausência de contaminação viral, todas as soluções de referência e amostras humanas devem ser manipuladas como potencialmente infectantes. Usar luvas cirúrgicas e avental. Seguir os procedimentos aceitos para laboratório para trabalhar com soro ou plasma. Não pipetar com a boca. Descartar todas as amostras, Pentes, Placas Reveladoras e outros materiais utilizados com o kit como resíduo bioinfectante. Não misturar reagentes de lotes diferentes. Não usar o kit após o vencimento. * Que serão amarzenados para documentar os testes Armazenamento e Estabilidade do Kit Kit é fornecido a 2-8º C. Durante o transporte o kit pode suportar temperaturas de <30º C por curtos períodos de tempo não excedendo no total as 48 horas. Os controles internos indicam que o kit não foi afectado durante o transporte. Armazenar o kit na embalagem original de 2 a 8º C Não congelar o kit Após a primeira utilização do kit os componentes devem ser armazenados de 2 a 8º C A performance do kit após a primeira utilização é estável até à data de validade do mesmo, quando armazenados de 2 a 8º C Após a primeira utilização, o pente e a placa não podem ser usados mais do que três vezes. Manipulação de Amostras Você pode testar tanto soro como plasma. As amostras podem ser armazenadas por 7 dias de 2-8 ºC antes do teste. Para armazenar por mais de 7 dias, congelar as amostras a - 20 ºC ou inferior. Centrifugar as amostras de soro após descongelamento. Testar o sobrenadante. Evitar ciclos repetidos de congelamento e descongelamento. Foram encontrados anticoagulantes tais como Heparin, EDTA e Citrato de Sódio não tendo qualquer efeito nos resultados do teste. Procedimento do teste Equipamento necessário Pipetas de precisão com ponteiras descartáveis para dispensar 50 µl. Tesoura Cronômetro ou relógio Preparando o Teste Trazer todos os componentes, Placas Reveladoras, pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realizar o teste à temperatura de 22 26ºC. Preparando a placa reveladora 1. Incubar a placa reveladora por 20 minutos em uma estufa à temperatura de 37 C, ou deixar à temperatura ambiente (22-26ºC) por três horas. 2. Cobrir a bancada de trabalho com papel absorvente para ser descartado como material bioinfectante no final do teste. 3. Misturar os reagentes pela agitação da placa reveladora. Nota: Não remover a cobertura de alumínio da Placa Reveladora. Furar a cobertura utilizando a ponteira descartável da pipeta ou o perfurador, somente quando for indicado nas instruções do Teste. Atenção: para garantir o funcionamento correto do teste, não tocar nos dentes do pente. 1. Rasgar a embalagem de alumínio do pente no local indicado. Remover o Pente. 2. O Pente e a Placa Reveladora podem ser utilizados total ou parcialmente. Para utilizar uma parte do pente: a. Determinar quantos dentes são necessários para testar as amostras e controles. É necessário um dente para cada teste. Cada dente apresenta o número de código 32 do kit a fim de possibilitar a identificação de dentes destacados. b. Dobrar e quebrar o Pente verticalmente ou cortar com a tesoura (veja Figura 4) para destacar o número necessário de dentes (nº de testes + 2 controles). c. Retornar a parte do Pente não utilizada para a embalagem de alumínio (com o dessecante). Fechar bem a embalagem, por exemplo, com um clips, para manter seco. Armazenar o Pente na caixa original do kit de 2 8ºC para uso posterior. ImmunoComb II Figura 4. Quebrando o Pente Instruções do teste Reação antígeno-anticorpo (fileira A da placa reveladora) 1. Pipetar 50 µl de amostra. Perfurar a cobertura de alumínio de uma cavidade da fileira A da Placa Reveladora com a ponteira da pipeta ou com o perfurador e dispensar a amostra no fundo da cavidade. Misturar vigorosamente a solução, aspirando e dispensando na cavidade. Descartar a ponteira. 2. Repetir o passo 1 para as outras amostras, incluindo um Controle Positivo e um Negativo fornecidos com o kit. Usar uma nova cavidade da fileira A e trocar a ponteira para cada amostra ou controle. 3. a) Inserir o Pente (o lado impresso de frente para você) nas cavidades da fileira A contendo as amostras e controles. Agitar: Inserir e retirar o Pente das cavidades várias vezes. b) Deixar o Pente na fileira A por 10 minutos exatos. Ajustar o cronômetro. Agitar 2 vezes durante a incubação inserindo e retirando o pente das cavidades. Próximo ao final dos 10 minutos, perfurar a cobertura da fileira B usando o perfurador. Não abrir mais cavidades que o necessário. c. Ao final dos 10 minutos, retirar o Pente da fileira A. Absorver o líquido residual nas pontas dos dentes em papel absorvente limpo. Não tocar na superfície frontal dos dentes. Primeira Lavagem (Fileira B) 4. Inserir o Pente nas cavidades da fileira B. Agitar: Retirar e inserir vigorosamente o Pente nas cavidades e deixar pelo menos 10 segundos para obter uma lavagem apropriada. Repetir a agitação várias vezes no período de 2 minutos; neste intervalo perfurar a cobertura da fileira C. Depois de 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual como no passo 3c. Ligação do Conjugado (Fileira C) 5. Inserir o Pente nas cavidades da fileira C. Agitar o Pente várias vezes. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Agitar como no passo 3b. Perfurar a cobertura da fileira D. Após 10 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Incubation no conjugate (Fileira D) 6. Inserir o Pente nas cavidades da fileira D. Agitar repetidamente durante 2 minutos, como no passo 4. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira E. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. 432/B4 2

3 Segunda Lavagem (Fileira E) 7. Inserir o Pente nas cavidades da fileira E. Agitar repetidamente durante 2 minutos. Neste intervalo, perfurar a cobertura da fileira F. Após 2 minutos, retirar o Pente e absorver o líquido residual. Reação de Cor (Fileira F) 8. Inserir o Pente nas cavidades da fileira F. Misturar. Ajustar o cronômetro para 10 minutos. Misturar como no passo 3b. Após 10 minutos retirar o Pente. Reação de Parada (Fileira E) 9. Inserir o Pente novamente na fileira E. Após 1 minuto retirar o Pente e deixar secar ao ar livre. Armazenamento da parte não utilizada do kit Placa Reveladora Se todas as cavidades da Placa Reveladora não foram utilizadas, podem ser guardadas para uso futuro: Selar as cavidades utilizadas com fita adesiva, de forma a evitar respingos, mesmo que a Placa Reveladora tenha sido esvaziada. Outros materiais do kit: Retornar o restante das Placas Reveladoras, Pentes, perfurador, controles e instruções de uso ao kit. Armazenar de 2 a 8ºC. Resultados do teste Validação Para confirmar o funcionamento correto do teste e demonstrar que os resultados são válidos, as três condições seguintes devem ser preenchidas (Figura 5): 1. O Controle Positivo deve produzir três pontos no dente do pente; 2. O Controle Negativo deve produzir apenas um ponto, na posição superior (controle interno); 3. Cada amostra testada deve produzir um ponto superior (controle interno). Isto também confirmará se a amostra foi adicionada. Caso alguma dessas condições não seja preenchida, os resultados são inválidos e as amostras e controles devem ser retestados. Controle positivo Controle negativo Figura 5. Validação do teste Resultados Inválidos Interpretação dos resultados O aparecimento de um ponto na posição superior (controle interno), indica que a amostra não é reativa para anticorpos para HIV-1 ou HIV-2 (Figura 6a). Um ponto circular intermediário colorido indica a presença de anticorpos para HIV-2 (figura 6b). Um ponto circular inferior colorido indica a presença de anticorpos do HIV-1 (Figura 6c). Algumas vezes, em altas concentrações de anticorpos anti-hiv-1 ou anti-hiv-2 observou-se a formação de um ponto secundário fraco além do ponto principal mais intenso, obtido com o antígeno homólogo (Figura 6d alta concentração de HIV-1). Em casos de coinfecção de HIV1 / HIV2, foram observados dois pontos ou de igual intensidade. a)sem anti-hiv anticorpos b) Anti-HIV-2 presente Figura 6. Resultados do teste c) Anti-HIV-1 presente d) Alta concentração de HIV-1 presente Importante: A presença de anticorpos para HIV-1 e/ou do HIV-2 na amostra testada deve ser confirmada por um ensaio confirmatório. Qualquer coloração clara no dente deve ser considerada como suspeita de representar uma reação positiva e deve ser devidamente investigada. Documentação dos Resultados Como a coloração desenvolvida no Pente é estável, os Pentes podem ser arquivados para documentação futura. Limitações O kit ImmunoComb II HIV 1& 2 BiSpot é um ensaio de triagem. A reatividade de anticorpos para HIV-1/HIV-2 não deve ser considerada como diagnóstico da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) ou de infecção por HIV. Como a produção de anticorpos do HIV pode demorar após a exposição inicial, a ausência de reatividade com este teste não deve ser considerada como evidência conclusiva de que o paciente não tenha sido exposto ao HIV ou infectado por ele. Características de Desempenhoº A. Estudo em Centros Europeus Realizou-se um estudo multicêntrico na Europa abrangendo 550 pacientes infectados com HIV-1 e 260 pacientes infectados com HIV-2, como também amostras de doadores de sangue que deram resultados negativos para infecção com HIV. Os resultados estão detalhados na Tabela 1. Tabela 1: Estudo multicêntrico ImmunoCom II HIV 1 & 2 BiSpot Referência Positivo Negativo HIV-1 HIV-2 HIV Positivo HIV Negativo Foram calculadas as seguintes características de desempenho: Sensibilidade - 100% Especificidade - 99,4% B. Estudos com amostras originárias da Africa Um estudo foi realizado com amostras de indivíduos de origem africana, incluindo 127 pacientes infectados com HIV-1, 62 infectados com HIV-2 e 15 coinfectados com HIV-1 e HIV-2, e 304 amostras de indivíduos com resultados negativos. Os resultados estão demonstrados na tabela 2. Tabela 2: Sensibilidade e especificidade com amostras de origem africana ImmunoCom II HIV 1 & 2 BiSpot Referência Positivo Negativo HIV-1 HIV-2 HIV Positivo HIV HIV HIV-2 Negativo Foram calculadas as seguintes características de desempenho: Sensibilidade - 100% Especificidade - 98,4% C. Soroconversão A capacidade do kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 BiSpot em detectar a soroconversão precoce do HIV-1 foi estudada em 10 painéis de soroconversão (Boston Biomedica, EUA), com Western Blot como ensaio de referência. A detecção da soroconversão pelo kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 BiSpot precedeu a detecção por Western Blot em média de 8,5 dias. D. HIV-1 subtipo O A capacidade do kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 BiSpot em detectar amostras positivas de HIV-1 subtipo O foi avaliada mediante um painel de referência da Agência de Saúde da França (ADM). Todas as amostras positivas para HIV-1 subtipo O foram detectadas. 432/B4 3

4 Tabela 3. Sumário das avaliações clínicas com HIV-1 subtipo O Local de Tipo de Número de Ano Avaliação Painel Amostras SensibiliDade* Israel 1994 Painel local (Cameroon) 9 100% França 1994 ADM Painel 10 90% França 1995 ADM Painel 3 100% França 1999 IAF Painel 3 100% França 2002 Painel local (Cameroon) 24 90% * Percentagem de amostras simples detectadas. Repetibilidade Um soro positivo foi ensaiado 12 vezes em 10 pentes, e numa leitura visual, em todos os casos, foram detectados resultados que indicavam que o soro era positivo. Reprodutibilidade Três soros positivos foram ensaiados em cada um de dez Kits, separadamente, e, em todos os casos, os resultados indicaram uma detecção de soros positivos. Reacções Cruzadas Com amostras positivas de outras doenças, tais como Hepatites A, B e C, HTLV, Rubéola, Citomegalovírus e Toxoplasma, não aconteceu nenhuma influência significativa. Interferência A interferência com amostras hemolíticas (hemoglobin até 10 mg/ml), lipémicas (Cholesterol até mg/dl; Triglycerids até mg/dl) e com bilirrubinas elevadas (até 20 mg/dl) foi insignificante. º Dados detalhados disponíveis em cima do pedido Bibliografia Boolaert G et. Al Comparative evatuation of eight commercial enzyme linked immunosorbent assays and 14 simple assays for detection of antibodies to HIV. Journal of Virology Methods, 105 (2); Constantine NT HIV antibody testing. P In P.T. Cohen, M.A. Sande, and P.A. Volberding (ed.). The AIDS knowledge. Base, 3 rd Lippincolt Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa. Gilmore, N Blood and blood product safety, p In J. Mann and D. Tarantola (ed.), AIDS in the World, vol II. Oxford University Press, Oxford, England. Grant AD, De Cock KM HIV infection and AIDS in the developing world. British Med. Journal, 322: Janssen RS et al New testing strategy to detect early HIV- 1 Infection for use in incidence estimates and for clinicas and prevention purposes. JAMA 280: Schacer TW, Hugu JP, Shea T, et al Biological and virological characteristics of primary HIV infection. Ann. Intern. Med. 128; UNAIDS/WHO Joint UN programme on HIVAIDS (UNAIDS) Report on the Global HIV/AIDS epidemic, p Geneva. Produzido por: ORGENICS LTD. P.O.Box 360, Yavne ISRAEL Registro e Distribuição: ORGENICS DO BRASIL LTDA. Alameda dos Ubiatans, Planalto Paulista São Paulo - SP CNPJ : / Atendimento ao consumidor SAC: (11) FAX: (11) orgenics@uol.com.br Uso exclusivo para diagnóstico "in vitro" Registro ANVISA nº Resp. Técnico : Marcelo Ferreira Carlos Cunha CRF-SP CONSERVAR ENTRE 2-8ºC Versão: 432/B4 (01/2005) Legenda dos símbolos CARD PLATE CONTROL + CONTROL - PERFORATOR IVD Σ 36 REF ImmunoComb cartão Placas reveladora Controlo Positivo Controlo Negativo Perfurador Consulte instruções para o uso Atenção, veja as instruções de uso No Dispositivo Médico Diagnóstico In Vitro Limitação da temperatura Contem suficiente material para 36 testes Fabricante Número de catálogo LOT código do lote Fabricante: Uso até número de série P.O.Box 360 Yavne 70650, Israel Tel: Fax: /B4 4

5 Resumo dos Principais Procedimentos do Teste Pré-incubação da Placa Reveladora: 3 hs à tempertaura ambiente ou 20 minutos a 37 C. Aspirar amostras e controles. Adicionar amostras e controles na fileira A. Misturar. Remover o Pente da embalagem. Inserir o Pente na fileira A e misturar. Incubar Abrir a fileira B. Absorver o líquido residual do Pente Inserir o Pente e agitar na fileira B. Incubar. Após misturar / agitar e incubar nas fileiras C, D e E Reação de cor na fileira F 9 Resultados 10 Resumo do Procedimento de Teste As instruções resumidas abaixo são para usuários experientes do kit ImmunoComb II HIV 1 & 2 BiSpot. (Para instruções detalhadas, por favor, ver o texto complete). 1. Trazer todos os componentes, Placas Reveladoras, Pentes, reagentes e amostras à temperatura ambiente e realize os teste à temperatura de 22-26ºC. 2. Dispensar 50 µl de cada amostra ou controle em cavidades separados da fileira A da Placa Reveladora e misturar. 3. Inserir o Pente na fileira A e continuar como descrito na Tabela 4. 1 Tabela 4. Resumo do Procedimento de Teste. Etapa Fileira Proceder como a seguir Reação antigéno-anticorpo A Misturar; incubar por 10 minutos; absorver. Primeira lavagem B Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Ligação do Conjugação C Misturar; incubar por 10 minutos; absorver. Ligação do Conjugação D Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Segunda lavagem E Agitar; incubar por 2 minutos; absorver. Reacção de coloração F Misturar; incubar por 10 minutos. Interrupção da reacção E Incubar por 1 minuto; secar ao ar livre. Dobrando e quebrando Pente 2 o 432/B4 5