leveduras Área/Laboratório Microbiologia

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1 21 a 27 de Julho de 2010 Universidade do Minho Escola de Ciências Departamento de Biologia Aplicação da Citometria de Fluxo (técnica citológica avançada) ao estudo de populações de Trabalho realizado por: Adriana América da Silva Manuel António Gonçalves de Pinho Sara Sofia dos Santos Marques leveduras Área/Laboratório Microbiologia

2 Citometria de Fluxo = Citologia analítica/ Citologia quantitativa > A técnica de Citometria de Fluxo é definida como sendo uma técnica citológica avançada utilizada para contar, analisar e classificar partículas microscópicas em suspensão. Cito + metria de Fluxo células medição Suspensas em meio líquido (em movimento)

3 Citometria: Citometria de Fluxo Citometria de Imagem Células em suspensão Amostra estática

4 Citometria de Fluxo Vantagens: Análise multiparamétrica; Num curto espaço de tempo analisa um grande nº de células; Análise célula a célula; > Grande importância no estudo de populações celulares não sincronizadas (as células encontram se em diferentes fases do ciclo celular). > Avaliação da homogeneidade ou heterogeneidade da população.

5 Citómetro de Fluxo > Tamanho (FSC) > Dispersão frontal da luz forward scatter > Complexidade (SSC) > Dispersão lateral da luz side scatter > Fluorescência Relativa (FL1, FL2, FL3, FL4 )

6 Componentes de um Citómetro de Fluxo: Mecânica > Suspensão de partículas > Fluxo laminar ( as células fluem em fila uma a uma) Óptica > Fonte de iluminação (feixe de luz) > Captação da luz dispersa e da fluorescência emitida Electrónic a > Conversão do sinal em valores analógico digitais > Aquisição, processamento, análise e armazenamento de dados no computador

7 Funcionamento do Citómetro de Fluxo > Na câmara de fluxo, a suspensão de partículas que vão ser analisadas é colhida por uma agulha e é imersa num líquido que se move a uma velocidade superior. O fluido envolvente é designado de líquido de embaínhamento. > O líquido de embaínhamento cria uma pressão positiva e faz com que as partículas sejam forçadas a moverem se em fila, uma a uma, no centro do fluido por um processo designado por focagem hidrodinâmica. > As partículas são analisadas, uma a uma, a velocidades de 100 a 1000 partículas/s

8 Funcionamento do Citómetro de Fluxo > As partículas em suspensão, de uma forma alinhada, são interceptadas por um feixe de luz. > A interacção das partículas com o feixe gera sinais que são captados por detectores apropriados. > A informação produzida pode ser gerada: Pela dispersão do feixe de luz; Pela fluorescência emitida por fluorocromos após excitação pelo feixe de luz.

9 Foto-sensor de Dispersão Frontal (FS) > Capta a intensidade da luz dispersa frontalmente o que nos fornece informações sobre o tamanho relativo das partículas (células); > A intensidade luz dispersa frontalmente é proporcional ao tamanho e forma das partículas. Laser Sensor de FS

10 Foto-sensor de Dispersão Lateral (SS) > Capta a intensidade de luz dispersa a 90 o > A intensidade da luz dispersa a 90 o é proporcional à complexidade, granularidade e forma das partículas. Laser Sensor de FS Sensor SS 90 0

11 Fluorescência > Capacidade de uma dada molécula emitir uma radiação electromagnética a um comprimento de onda superior ao da radiação incidente. Fluoresceína λ = 530 nm λ = 480 nm OH O Luz Incidente de maior energía Fluorocromo CO 2 H Luz fluorescente emitida tem menor energia e maior comprimento de onda

12 Dispersão da Fluorescência > A fluorescência emitida é detectada por foto sensores que captam a luz com um comprimento de onda seleccionado. > A especificidade da detecção de cada sensor é controlada pela selecção do comprimento de onda, através de uma conjugação de filtros e de espelhos dicróicos. Laser Sensor de FS Detectores de Fluorescência (PMT1, PMT4 etc.)

13 Espelho Dicróico -Colocado a 45 o Fonte de Luz Luz Transmitida Luz Reflectida

14 Espelhos Dicróicos > Os Espelhos Dicróicos são Filtros responsáveis por separar a radiação (divisão da fluorescência em várias cores, FL 1, FL 2, FL 3 e FL 4), permitindo medições simultâneas de vários parâmetros numa só amostra.

15 Cell Sorting > Os separadores físicos permitem separar partículas de interesse para compartimentos alvo; > A separação éconseguida por vibração da corrente de fluido por aplicação de uma frequência muito elevada levando àformação de gotículas com 0 ou 1 partícula (idealmente); > Se as partículas satisfizerem os critérios impostos é adicionada uma carga eléctrica; > As gotículas ao caírem passam por duas placas metálicas, fortemente carregadas positivamente ou negativamente as gotículas são conduzidas pelas placas de polaridade oposta para um compartimento de colheita.

16 Cytometric Bead Array (CBA) Assays > O CBA consiste numa mistura de esferas fluorescentes com diferentes intensidades, mas uniformes no tamanho e conjugadas com anticorpos. Desta forma, o analíto é capturado pela partícula e marcado com outro anticorpo, este com fluorescência distinta da esfera. Assim, a fluorescência obtida tornase proporcional àconcentração do analíto na amostra.

17 Trabalho de laboratório Aplicação da Citometria de Fluxo (técnica citológica avançada) ao estudo de populações de leveduras

18 Objectivos: Avaliação do efeito do etanol e do ácido acético na perda de integridade da membrana plasmática e na degradação mitocondrial na levedura Saccharomyces cerevisiae Princípios: > O iodeto de Propídeo (IP) éuma sonda fluorescente que permite avaliar a integridade da membrana plasmática; > se a célula integrar IP poderemos concluir que houve perda da integridade da membrana plasmática uma vez que em situações normais as células são impermeáveis a IP. > a degradação mitocondrial pode ser monitorizada pela expressão de uma fusão da Green Fluorescent Protein (GFP) com a citrato sintetase da matriz mitocondrial ; > esta fusão permite visualizar a morfologia do compartimento mitocondrial e monitorizar a sua degradação pela detecção da perda de fluorescência verde.

19 Protocolo: A estirpe Saccharomyces cerevisiae W303 1A transformada com o plasmídeo pyxmtgfp foi cultivada overnight em meio de cultura Synthetic Complete com galactose sem triptofano, a 30⁰C, 160 r.p.m. Procedeu se à preparação e recolha das células e àsua suspensão nas seguintes condições: Tubo0 10 ml de meio de cultura SCGal TRP. Tubo1 10 ml de meio de cultura SCGal TRP, ph 3.0, 140mM ácido acético. Tubo2 10 ml de meio de cultura SCGal TRP, 10% (v/v) de etanol. Tubo3 10 ml de meio de cultura SCGal TRP, 12% (v/v) de etanol. Tubo4 10 ml de meio de cultura SCGal TRP, 14% (v/v) de etanol. Observou se ao microscópio de fluorescência de uma amostra do Tubo 0.

20 Resultados e discussão dos resultados: 1º observação ao microscópio: Sem qualquer tratamento Com ácido acético

21 Protocolo: 1ª parte- Citómetro de Fluxo Retiraram se amostras dos diferentes meios de cultura para análise no citómetro de fluxo aos seguintes tempos: > T75 (75 min. ) > T145 (145 min.) > T230 (230 min.) > T380 (380min.) para análise da fluorescência verde (degradação mitocondrial) e para análise da fluorescência vermelha (integridade da membrana plasmtica) após 5 min. de incubação à temperatura ambiente, no escuro.

22 Resultados e discussão : 1ª parte- Citómetro de Fluxo A AF_W303_T0 (autofluorescência aos 0 min) > A partir da análise do scattergram podemos avaliar a homogeneidade da população no que respeita ao tamanho relativo e complexidade relativa D E > as células que se encontram rodeadas, no scattergram, pelo gate A são analisadas quanto à sua fluorescência vermelha no 2º gráfico (histograma monoparamétrico de FL 4) > Toda a população analisada localiza se na zona D, pelo que a amostra não tratada apresenta marcação IP.

23 Resultados e discussão: GFP_W303_T0 IP_W303_T0

24 Resultados e discussão:

25 Resultados e discussão:

26 Resultados e discussão: IP_W303_10%_T380 IP_W303_T0 IP_W303_14%_T380

27 Protocolo: 2ª parte- Imunofluorescência Colocou se 10 μl de células (previamente sujeitas a 14% de etanol, sendo submetidas a várias centrifugações, incubações e lavagens em que se utilizou sorbitol 1.2M; β mercaptoetanol; zymolyase 20T 1000 mg/ml, etc ) em cada poço de uma lâmina para imunofluorescência. Os anticorpos utilizados foram o anti citocromo c diluído 1:100 e o mouse FITC diluído 1:20 (ambos diluídos em leite). No final, montou se com vectashield, selou se com verniz e observou se ao microscópio.

28 Resultados e discussão Cyc_W303_T0 Cyc_W303_14%_T400

29 Conclusão: Tanto o ácido acético como o etanol causam danos nas leveduras uma vez que, como podemos constatar pelas experiências realizadas, a partir de determinadas concentrações estes tornam se citotóxicos; O ácido acético apresenta maior citotoxicidade que o etanol; Quanto maior for a concentração de etanol e maior o tempo de incubação, maior será a degradação das mitocôndrias e perda de integridade da membrana celular; Através da citometria de fluxo conseguimos confirmar a degradação do compartimento mitocondrial e a perda de integridade da membrana plasmática; Através da microscopia conseguimos confirmar a alteração na morfologia das mitocôndrias e a sua fragmentação.

30 Bibliografia: Kitagaki H., Arakia Y., Funatob K., e Shimoi H. (2007) Ethanol induced death in yeast exhibits features of apoptosis mediated by mitochondrial fission pathway, FEBS Letters, Japan, Gregori G., Ragheb K., Robinson, J. P. (2003) Introduction to WinMDI 2.8 for the Analysis of Flow Cytometry Listmode Data Files, Purdue University Cytometry Laboratories, July, Versão1.0

31 TzÜtwxv ÅxÇàÉáM Agradecemos a participação de Ana Patrícia Pimenta Martins Ribeiro e agradecemos a colaboração das investigadoras: Manuela Côrte-Real e Susana Chaves