Disciplina: Bioquímica Clínica Curso: Análises Clínicas 3º. Módulo Docente: Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini

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1 Disciplina: Bioquímica Clínica Curso: Análises Clínicas 3º. Módulo Docente: Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini

2 Fundamentos da Espectrofotometria Uma maneira boa de cutucar moléculas, é com radiação eletromagnética (luz) A espectrofotometriafaz parte da classe dos métodos analíticos que baseiam-se na interação da matéria com a energia radiante Boa sensibilidade Baixo custo de análise Fácil operação Equipamentos robustos Luz incidente Luz absorvida Luz emergente Perdas: -reflexões -dispersão -absorção

3 Fundamentos da Espectrofotometria (a) (b) Espectro visível da luz de uma lâmpada difratada por um prisma: (a) esquema e (b) fotografia. Arco-Íris: exemplo de difração de luz produzida na natureza.

4 Fundamentos da Espectrofotometria Porque ocorre o fenômeno da absorção? Moléculas que apresentam elétrons que podem ser promovidos a níveis de energia mais elevados mediante a absorção de energia.

5 Cores de Radiação Região do Visível

6 Teoria da Espectrofotometria Lei de Lambert-Beer Quando uma radiação monocromática passa através de uma solução, uma parte da energia é absorvida pelo meio, enquanto a parte restante é transmitida.

7 Teoria da Espectrofotometria Lei de Lambert-Beer Grandezas: 1- Transmitância 2- Absorbância

8 Teoria da Espectrofotometria Lei de Lambert-Beer Grandezas: 1- Transmitância: quantidade de energia radiante transmitida pela solução. A transmitância é dada pela relação entra a intensidade da radiação transmitida (I) e a intensidade da radiação incidente(io),ouseja,t=i/io. Seuvalorvariadezeroa1(ou0a100%) T=O todaaluzincidenteéabsorvida(i=o) T=1 todaaluzincidenteétransmitida(i=io). 2- Absorbância

9 Teoria da Espectrofotometria Lei de Lambert-Beer Grandezas: 1- Transmitância: 2- Absorbância quantidade de energia radiante absorvida pela solução. A absorbância ou densidade óptica (DO) é diretamente proporcional à concentração da amostra. Para se determinar a concentração de uma determinada solução, geralmente utiliza-se um Fator de Proporcionalidade (ou Fator de Calibração), o qual é obtido através da relação entre a concentração e a absorbância de uma solução padrão de concentração exatamente conhecida.

10 Teoria da Espectrofotometria Lei de Lambert-Beer 2-Absorbância Uma vez conhecido o Fator de Proporcionalidade, fica fácil se descobrir a concentração da solução teste. Basta realizar a seguinte equação:

11 Praticando: 1-Determine o Fator de Proporcionalidade de uma amostra, sabendo: [padrão] = 12,4 g/dl abs. padrão = 0,52

12 Praticando: 2-Sabendo que o Fator de Proporcionalidade de uma amostra é 22,4. Qual o valor da [padrão] se a abs. padrão for de 0,33?

13 Lei de Lambert-Beer A espectroscopia de absorção molecular está baseada na medida de absorbância (A) ou transmitância (T), que estão relacionadas através das equações: Io I T= I/Io(%T = 100x T) A = log(1/t) = log(i/io) A=0 T= 1 100% Transmissão A=0,9 T=0,1 10 % transmissão 90% Absorção

14 Lei de Lambert-Beer A absorbância é muito importante porque ela é diretamente proporcional à concentração de espécies absorventes de luz na amostra.

15 Partes Essenciais de um Espectrofotômetro Fontes de radiação; Monocromador; Compartimento de amostra; Detector.

16 Fontes de Radiação Fonte de energia radiante capaz de emitir uma mistura de comprimento de onda. Lâmpada de tungstênio: utilizada para região UV próximo e visível Lâmpada de deutério: utilizada para a região do UV

17 Filtros de vidro: transmitem faixa ampla de comprimento de onda; Prismas: transmitem pequena faixa de onda; Redes de difração: transmitem pequena faixa de comprimento de onda. Sistema Óptico

18 Cubetasde Medida

19 Detectores Utilizados para receber a energia radiante transmitida através da solução e transformá-la em energia elétrica.

20 Espectrofotômetros Feixe Simples Feixe Duplo

21 Espectrofotômetros com duplo feixe

22 Espectrofotômetros com duplo feixe

23 Análises Quantitativas

24 Análises Quantitativas

25 Análises Quantitativas

26 Análise Qualitativa Lo og ε 2,0 2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 D C A ou B Comprimento de onda (nm) C 5 H 11 R OH C 5 H 11 OH (A) (C) OH OH C 5 H 11 R OH OH (B) (D) OH C 5 H 11 OH Espectro de absorção do canabidiol comparado com outros fenóis.