TÉCNICAS MICROSCÓPICAS ESTUDO DA MORFOLOGIA E DA ESTRUTURA CELULAR

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1 TÉCNICAS MICROSCÓPICAS ESTUDO DA MORFOLOGIA E DA ESTRUTURA CELULAR

2 (In L. McKane, J Kandel, Microbiology Essentials and Applications, McGraw Hill, 2nd ed)

3 MICROSCÓPIO ÓPTICO COMPOSTO* * Imagem formada pela acção de 2 conjuntos de lentes (objectiva x oculares) O poder de resolução de um microscópio determina a ampliação máxima útil do microscópio

4 Poder de Resolução do Microscópio Óptico* *Capacidade de tornar claramente visíveis e distinguir como entidades separadas dois objectos separados Comprimento de onda da luz que incide no objecto (normalmente, entre 400 e 750 nm) d = 0,5. λ η. Senθ Indice de refracção do meio entre a lamina de vidro e a lente da objectiva η=1 Ar η=1,52 vidro; óleo de imersão Abertura angular Condenser Lamp Light (λ) Light (λ) d distância mínima entre dois objectos (p.ex. Células ou estruturas subcelulares) que os revela como entidades claramente distintas Menor valor d maior poder de resolução do microscópio

5 40 x 100x (Imersion lens) Imersion oil mm 0.1 mm Resolution power (with blue light λ = 450 nm) 0.35 µm 0.20 µm Refracted light Objective lens Reflected light (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

6 Staining: increasing contrast for bright-field microscopy

7 Aumenta o contraste / visibilidade das células ou estruturas subcelulares Acentua caracteristicas morfológicas específicas Permite preservar as preparações Facilita diagnóstico de microrganismos específicos (ex. Coloração de Gram, coloração com fluorocromos, etc.) PASSOS PRINCIPAIS Coloração de células 1. Fixação (estruturas internas e externas são preservadas e mantidas em posição fixa; as células são fixadas à lâmina de vidro). Fixação química (preserva estrutura subcellular fina). Fixação por acção do calor 2. Tratamento da preparação com corantes. Coloração simples (p.ex. com corantes básicos carga positiva). Coloração diferencial (envolve o uso de mais do que um corante) - Divide microrganismos em grupos com base na sua coloração (P.ex. Coloração de Gram Distingue bactérias Gram negativas e Gram positivas, devido a diferenças na estrutura da parede celular). Coloração de estruturas específicas

8 Some stains used in bacteriology Coloração negativa (observação de cápsula à volta das células) Escherichia coli (bactéria Gram negativa) Coloração de flagelos de Salmonella thyphi (In L McKane & J Kandel, Microbiology: essentials and applications, McGrawHill, 2nd ed.)

9 VÁRIOS TIPOS DE MICROSCÓPIO ÓPTICO COMPOSTO Microscópio de campo claro ( bright-field microscope ) Microscópio de campo escuro ( dark-field microscope ) Microscópio de contraste de fase ( phase-contrast microscope ) Microscópio de contraste de interferência diferencial (DIC, differential interference contrast microscope ) Imagem com maior contraste Microscópio de fluorescência ( fluorescence microscope )

10 Células da levedura Saccharomyces cerevisiae Campo claro Contraste de fase Campo escuro - usa luz visível - Não resolve estruturas mais pequenas que 0,20 µm - Simples e barato - Ideal para observação de células coradas (ver COLORAÇÂO) -Desvantagem: baixo contraste entre as células e o meio exterior, e entre as estruturas subcelulares/organelos e o citoplasma das células. - usa luz visível - Poder de resolução máx: 0,20 µm - Sistema óptico especial (condensador; objectivas) que permite distinguir pequenas diferenças no indice de refracção (p.ex. entre o citoplasma e o exterior; entre os organelos e o citoplasma) - Resultado: melhor contraste - Permite observação de alguns detalhe intracelulares em células vivas - usa luz visível - Poder de resolução máx: 0,20 µm - Condensador especial (disco opaco bloqueia a entrada de luz directamente na objectiva; somente é observada a luz reflectida pelo objecto) - Resultado: melhor contraste que campo claro (celulas brilhantes sobre fundo escuro) - Desvantagem: pouco detalhe subcelular Excelentes para observar células vivas, não coradas

11 Célula do protozoário Paramecium Microscópio de Contraste de interferência diferencial (DIC; Nomarski) Contraste de fase - Como no microscópio de contraste de fase, usa diferenças nos indices de refracção das estruturas ou materiais que a luz atravessa, para formar imagens. Usa dois feixes de luz, separados por acção de prismas. - Resultado: imagem tridimensional, colorida (cor artificial). - Não requere coloração das células. - Melhor resolução que microscópio de contraste de fase - Excelente para observar células vivas (detalhes de estruturas subcelulares) Yeast cells nucleus

12 Imagens obtidas com o microscópio de fluorescência 2 tipos de bactérias, Micrococcus sp. e Bacillus sp., em amostra de solo (células coradas com o corante comercial LIVE/DEAD Bac Light Bacterial Viability Staining kit mistura de 2 corantes que fluorescem com cores diferentes: Corante verde penetra células com membrana plasmática intacta; Corante vermelho penetra células com membrana danificada) viáveis Quistos do protozoário Giardia sp. (contaminante de água) em matéria fecal (IMUNOFLUORESCÊNCIA) mortas ( Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa (Imunofluorescência) (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) (Handbook of Fluorescent Probes and Reserch Chemicals, Molecular probes, 1999)

13 Microscópio de Fluorescência - Expõe o objecto a radiação Ultra-Violeta, violeta ou azul (λ ~ nm); - As células a observar estão normalmente coradas com um composto fluorescente (fluorocromo) ou apresentam auto-fluorescência; - Imagem formada com base na luz fluorescente emitida pelo fluorocromo (na célula) após excitação; - Poder de resolução máx: 0,18 µm - Aplicações: - Visualização de células in situ (coradas com fluorocromos ou autofluorescentes) - Distinção entre células viáveis (activas) ou mortas (uso de fluorocromos específicos) - Diagnóstico rápido de microrganismos específicos em amostras clínicas, ambientais, alimentares, etc. (p.ex. por imunofluorescência, e por técnicas de FISH - Fluorescent in situ hybridization, etc.) Instrumento essencial em estudos de ecologia microbiana do solo, diagnóstico de microrganismos em alimentos, microbiologia clínica, etc. (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) ( )

14 Espectro electromagnético Fluorescência ( Diagrama de Jablonski Processos envolvidos na criação dum estado electrónico singleto excitado numa molécula ( fluorocromo), por absorção de um fotão de energia, e subsequente emissão de fluorescência. (Handbook of Fluorescent Probes and Reserch Chemicals, Molecular probes, 1999) 1 Excitação (por radiação ultravioleta, violeta ou azul; fonte externa de energia: lâmpada incandescente, p.ex. de Hg, ou laser) 2 Tempo de vida do estado-excitado (1-10 x 10-9 segundos) 3 - Emissão de fluorescência

15 Exemplo de IMUNOFLUORESCÊNCIA (no diagnóstico de microrganismos). Anticorpo que se liga especificamente a um determinado microrganismo é combinado com fluorocromo. (P.ex. Fluoresceína emite luz verde). O anticorpo combinado é adicionado às células fixadas sobre uma lâmina e vai ligar-se a moléculas específicas (antigéneos) presentes na superfície das células do microrganismo que se pretende detectar; In M McKane & J Kandel, Microbiology: essentials and applications, McGrawHill, 2nd ed.). As células às quais o anticorpo se ligou fluorescem (cor verde, no caso do fluorocromo ser a fluoresceína) após serem sujeitas a radiação com comprimento de onda adequado para excitar a molécula do fluorocromo. OBTENÇÃO DOS ANTICORPOS (disponíveis comercialmente) ANTIGÉNEOS macromoléculas presentes nas células microbianas (p.ex. proteínas, lipoproteínas, polissacáridos da parede celular, etc. ) ou nos vírus ANTICORPOS moléculas que são produzidas por animal infectado (resposta imunitária) e que têm a capacidade de se ligar específicamente aos antigéneos que induziram a sua produção

16 Imagens obtidas com o microscópio de fluorescência 2 tipos de bactérias, Micrococcus sp. e Bacillus sp., em amostra de solo (células coradas com o corante comercial LIVE/DEAD Bac Light Bacterial Viability Staining kit mistura de 2 corantes que fluorescem com cores diferentes: Corante verde penetra células com membrana plasmática intacta; Corante vermelho penetra células com membrana danificada) viáveis Cistos do protozoário Giardia sp. (contaminante de água) em matéria fecal (IMUNOFLUORESCÊNCIA) mortas ( Bacillus cereus e Pseudomonas aeruginosa (Imunofluorescência) (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) (Handbook of Fluorescent Probes and Reserch Chemicals, Molecular probes, 1999)

17 Microscópio confocal de laser - Usa luz emitida por laser para iluminar um plano do objecto de cada vez. - Normalmente, células são coradas com fluorocromo(s) - Imagem bi-dimensional ou tri-dimensional final construida por aplicação informática - Poder de resolução elevado (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) - Aplicações: - análise de camadas de microrganismos em biofilmes; - análise do conteudo microbiano de amostras espessas, em profundidade (p.ex.,em tecidos, solo) ; - ecologia microbiana (amostras ambientais) Filamentos de cianobactéria em amostra de solo (In Brock Biology of Microorganisms, 11th edition, Prentice Hall)

18 Transmission Electron Microscope Resolution power of optical and electronic microscopes compared to the dimensions of cells, organelles and molecules: Phase contrast microscope (1000 x) Transmission electron microscope ( x) Subcellular structures (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) Virus influenza Bacteria Rhodospirillum rubrum

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20 Microscópio Electrónico de Transmissão - Usa um feixe de electrões (em vez de luz visível) (comprimento de onda muito mais curto: λ ~ 0,012 nm) e magnetes em vez de lentes de vidro nas objectivas, condensadores, etc. - Poder de resolução máximo ~ 0,5 nm ( permite resolver estruturas muito pequenas, em comparação com o microscópio óptico)) - Ampliação máxima útil: ~ x - Imagem bi-dimensional, formada com base no desvio de electrões pelas estruturas mais densas do objecto e transmissão através das regiões de baixa densidade. (regiões densas vs. transparentes) - Meio de propagação do feixe electrões é o alto-vácuo (para evitar desvio de electrões por particulas do ar) - Aplicações: observação de virus; observação da ultraestrutura interna de células do tipo procariótico ou eucariótico. (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) - Preparação da amostra complexa e morosa.

21 Microscópio Electrónico de Varrimento ( Scanning Electron Microscope ) - Usa electrões reflectidos pela superfície do objecto para formar a imagem; - Poder de resolução: ~ 5 nm - Imagem tridimensional (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed) - Observação de características da superficie de células e virus e estrutura de colónias, directamente na superfície de tecidos e diversos tipos de outros materiais.

22 Scanning Electron Micrographs Hyphae of fungi, and Bacteria colonies bacterial cells over a soil particle (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)

23 In L. McKane e J. Kandel, Microbiology: essentials and applications, McGrawHill, 2nd ed.) Dupla hélice de DNA (3 voltas) observada por microscopia de varrimento de túnel (cor é artificial) (In Prescott, Harley & Klein, Microbiology, McGrawHill, 6th ed)