FluoroSpheres N.º de Código K0110

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1 FluoroSpheres N.º de Código K0110 6ª edição Esferas de calibração para a monitorização diária do citómetro de fluxo. O kit contém reagentes para 40 calibrações. ( ) SSK0110CE_02/PT/ p. 1/8

2 Índice Página Utilização Prevista... 2 Síntese e Explicação... 2 Princípio do ensaio... 2 Reagentes... 3 A. Materiais fornecidos... 3 B. Materiais necessários mas não fornecidos... 3 Armazenamento... 3 Procedimento do ensaio e aquisição de dados... 4 Análise de dados, curva de calibração... 4 A. Definições... 5 B. Calibração manual. Para instrumentos que exprimem a IMF em valores lineares... 5 C. Calibração manual. Para instrumentos que exprimem a IMF em números de canais.. 6 Utilização Prevista Para utilização em diagnósticos in vitro. As FluoroSpheres destinam-se à monitorização do desempenho do citómetro de fluxo. Síntese e Explicação O kit fornece Blank Beads e Calibration Beads com 3,2 µm de tamanho. As Calibration Beads consistem numa mistura de 5 populações de esferas com intensidade de fluorescência diferente, bem como uma população de esferas não fluorescentes. As esferas fluorescentes contêm uma combinação de fluorocromos únicos que permitem a excitação por luz de qualquer comprimento de onda entre os 365 e os 650 nm. Dado que os fluorocromos das esferas são diferentes dos fluorocromos normalmente usados em citometria de fluxo, as suas propriedades espectrais são diferentes. Em consequência, as esferas não podem ser utilizadas para a compensação da fluorescência. Dado que as moléculas de fluorocromo equivalente (MEF) possuem determinados valores correspondentes às populações de esferas fluorescentes, o uso das FluoroSpheres permite a transformação de unidades arbitrárias de intensidade média de fluorescência (IFM) em unidades absolutas para fins da garantia da qualidade e execução de relatórios sobre os dados obtidos por citometria de fluxo. Princípio do ensaio 1. Em primeiro lugar, analisam-se as Blank Beads para que se definam os melhores parâmetros do instrumento em todos os canais de interesse. 2. Em segundo, analisam-se as Calibration Beads. Os dados são utilizados para a construção da curva de calibração da IMF em função das MEF. A curva de calibração e os parâmetros estatísticos a ela associados são utilizados para avaliar a linearidade do instrumento. Além disso, pode também determinar-se o limite de detecção e a gama dinâmica do instrumento a partir da curva de calibração. ( ) SSK0110CE_02/PT/ p. 2/8

3 A calibração com as FluoroSpheres pode efectuar-se de duas formas: Parâmetros do instrumento constantes Quando se utiliza este método, todos os parâmetros do instrumento se mantêm inalterados ao longo do tempo. As IMF dos diferentes picos são monitorizadas, sendo os resultados exibidos sob a forma de data de calibração versus IMF. Respostas do instrumento constantes Por este método, a voltagem PMT é ajustada de forma a que a IMF de um dos picos de fluorescência elevados apareça sempre no mesmo canal, sem excepção. Os resultados são então exibidos sob a forma de data de calibração versus voltagem PMT. Reagentes A. Materiais fornecidos Frasco 1 1,7 ml Em azida sódica 0,02%, NP40 0,01% Frasco 2 1,7 ml Contém Blank Beads e 5 populações de esferas com quantidades diferentes de fluorocromos expressos em valores MEF, para, respectivamente, FITC, RPE, RPE-TxRed, Cy5 e APC. Caso deseje saber os valores de MEF específicos do lote, consulte por favor a folha de valores analíticos inclusa. Em azida sódica 0,02%, NP40 0,01%. B. Materiais necessários mas não fornecidos Equipamento geral de laboratório para procedimentos de citometria de fluxo Papel milimétrico semi-logarítmico e logarítmico duplo de 5 ciclos Calculadora Programas de software para análise de dados obtidos por citometria de fluxo Programas de folhas de cálculo, como o Microsoft Excel. Estes programas são opcionais Precauções 1. Para utilizadores profissionais. 2. Este produto contém azida sódica (NaN 3 ), uma substância química altamente tóxica na forma pura. Em concentrações de produto, mesmo não classificadas como perigosas, a azida sódica poderá reagir com as canalizações de chumbo e de cobre, formando acumulações de azidas metálicas altamente explosivas. Ao descartar, lavar com grandes quantidades de água a pressão, a fim de evitar a acumulação de azidas metálicas na canalização. Armazenamento Armazenar entre 2 e 8ºC. Não utilizar após a data de validade inscrita nos frascos. Caso os reagentes sejam armazenados noutras condições para além das que se encontram especificadas, o utilizador deve verificar tais condições. Caso se observem resultados inesperados que não possam ser explicados por variações nos procedimentos de laboratório e se suspeite de um problema com o kit, contactar o nosso Centro de Assistência Técnica. ( ) SSK0110CE_02/PT/ p. 3/8

4 Procedimento do ensaio e aquisição de dados 1. Misture vigorosamente as esferas com um misturador vórtice ou por agitação. 2. Adicione 0,5 ml de um tampão de diluição apropriado, como soro fisiológico tamponizado com fosfato, a ph 7,2, a cada um dos tubos de ensaio. Adicione uma gota do frasco 1, Blank Beads, ao primeiro tubo, bem como uma gota do frasco 2, Calibration Beads, ao segundo tubo. Agitar por meio de um misturador de vórtice para assegurar que as células fiquem em suspensão. 3. Antes da aquisição de dados, seleccione a amplificação logarítmica dos detectores de fluorescência desejados, definindo a compensação da fluorescência, em todos os parâmetros, como zero. 4. Aplique o tubo com as Blank Beads ao citómetro de fluxo. 5. Ajuste as voltagens PMT de forma a permitir que o pico das Blank Beads apareça na primeira década do histograma. 6. Utilizando a dispersão frontal versus a dispersão lateral, defina a porta para aceitar singletos de esferas (ver Figura 1). 7. Obtenha pelo menos resultados ligados para as Blank Beads. 8. Aplique o tubo com as Calibration Beads ao citómetro de fluxo e obtenha dados relativos a pelo menos resultados ligados. 9. Devem ser visíveis seis picos de intensidade de fluorescência no canal de fluorescência desejado (ver Figura 2). Análise de dados, curva de calibração A análise dos resultados está confinada a singletos de esferas ligados, sem detritos, tal como é definido no gráfico de pontos de dispersão frontal versus dispersão lateral (ver Figura 1). Cada marcador ou região é utilizado para definir cada uma das 6 populações de Calibration Beads (ver Figura 2). As regiões são usadas para determinar a IMF de cada população de esferas. Figura 1. Dispersão frontal versus dispersão lateral das Blank Beads. A porta foi definida para recolher singletos de esferas. ( ) SSK0110CE_02/PT/ p. 4/8

5 855 R5 R6 R3 R4 641 R2 R1 Counts FL1-H Figura 2. Histograma das populações de esferas de FluoroSpheres. A. Definições Valor na origem O valor na origem representa o valor da fluorescência no canal 0. O canal 0 é normalmente representado no software do fabricante por valores arbitrários, como 1 na maioria do software da Becton Dickinson e 0,1 na maior parte do software Coulter. AvgRes% A percentagem residual média (AvgRes%) é uma medida não pesada da linearidade de resposta do instrumento. É calculada determinando em que percentagem absoluta média a linha de regressão varia dos pontos reais. r 2 O coeficiente de determinação (r 2 ) é uma medida pesada da linearidade. É mais útil quando se analisam dados logarítmicos. Limite de detecção Mesmo apesar de as Blank Beads não possuírem fluorocromos, podem dar origem a um sinal. Este sinal representa o ruído de fundo que é, por conseguinte, o nível de detecção do instrumento. MEF As moléculas de fluorocromo equivalente representam a quantidade de fluorocromo por esfera. Década logarítmica A década logarítmica é a gama completa calibrada, ou gama dinâmica do parâmetro de fluorescência que está a ser calibrado. Os citómetros de fluxo costumam vir acompanhados de amplificadores com uma gama dinâmica de 3,5 ou 4 décadas logarítmicas, dependendo do fabricante. A diminuição do desempenho do citómetro de fluxo afecta a década logarítmica. B. Calibração manual. Para instrumentos que exprimem a IMF em valores lineares Construção da curva de calibração: 1. Determine o IMF para cada uma das 6 populações das Calibration Beads das FluoroSpheres. ( ) SSK0110CE_02/PT/ p. 5/8

6 2. Faça o gráfico do log IFM em função do log MEF correspondente para os diferentes picos. Calcule a melhor linha recta de acordo com a fórmula seguinte: log (MEF) = a x log (IFM) + b em que a é o declive e b é a intersecção no eixo dos yy, também denominada de valor na origem ou valor do canal Calcule os parâmetros estatísticos associados AvgRes& % e r 2 da curva de calibração. 4. A gama dinâmica do amplificador é expressa em décadas logarítmicas. As décadas logarítmicas podem ser calculadas a partir da linha de regressão subtraindo o log (MEF min ) do log (MEF max ). O log (MEF min ) e o log (MEF max ) derivam dos valores de IMF mínimos e máximos, respectivamente. No caso presente, a IMF para o MEF min e o MEF max é de 10 0 e 10 4, respectivamente. Figura 3. Curva de calibração (linha de regressão) baseada nas FluoroSpheres. Exemplo de cálculo: décadas logarítimicas = log (MEF max ) - log (MEF min ) décadas logarítimicas = log ( ) - log (30.8) décadas logarítimicas = décadas logarítimicas = 3.79 Canais por década: Dado que o número de canais é de 1024, o número de canais por década é de: 1024/3.79 = 270 C. Calibração manual. Para instrumentos que exprimem a IMF em números de canais Construção da curva de calibração: 1. Determine o IMF para cada uma das 6 populações das Calibration Beads das FluoroSpheres. 2. Faça o gráfico da IFM em função do log (MEF) e calcule a melhor linha recta de acordo com a fórmula seguinte: log (MEF) = a x IFM + b em que a é o declive e b é a intercepção no eixo dos yy. 3. Calcule os parâmetros estatísticos associados AvgRes& % e r 2 da curva de calibração. ( ) SSK0110CE_02/PT/ p. 6/8

7 4. A gama dinâmica do amplificador é expressa em décadas logarítmicas. As décadas logarítmicas podem ser calculadas a partir da linha de regressão subtraindo o log (MEF min ) do log (MEF max ). O log (MEF min ) e o log (MEF max ) derivam dos valores de IMF mínimos e máximos, respectivamente. No caso presente, a IMF para o MEF min e o MEF max é de 0 e 1023, respectivamente. Figura 4. Curva de calibração (linha de regressão) baseada nas FluoroSpheres. Exemplo de cálculo: décadas logarítimicas = log (MEF max ) - log (MEF min ) décadas logarítimicas = log ( ) - log (30.8) décadas logarítimicas = décadas logarítimicas = 3.79 Canais por década: Dado que o número de canais é de 1024, o número de canais por década é de: 1024/3.79 = 270 ( ) SSK0110CE_02/PT/ p. 7/8

8 Explicação dos símbolos Número de catálogo Limites de temperatura Utilizar até Dispositivo médico para diagnóstico in vitro Consultar as instruções de utilização Conteúdo suficiente para <n> ensaios Código de lote Fabricante Produzido por: Dako Denmark A/S Produktionsvej 42 DK-2600 Glostrup Dinamarca Tel Fax ( ) SSK0110CE_02/PT/ p. 8/8