Reações Ag-Ac. Testes Sorológicos / Técnicas de Imunodiagnóstico 03/06/2015 INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO

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1 Reações Ag-Ac INTERAÇÕES ANTÍGENO-ANTICORPO Testes Sorológicos / Técnicas de Imunodiagnóstico Prof. Helio José Montassier Detecção, quantificação e caracterização de anticorpos (Acs) ou de antígenos (Ags) e seu uso como ferramenta para pesquisa e diagnóstico IMUNODIAGNÓSTICO: Diagnóstico laboratorial por meio de técnicas imunológicas Interação Ag-Ac: Conceito Inicial SERVE PARA PROCURAR (DETECTAR / IDENTIFICAR / MENSURAR):- Anticorpos ou Antígenos no organismo vertebrado suspeito de estar infectado com um determinado agente infeccioso, usando-se técnicas sorológicas de Precipitação, Aglutinação, Fixação de complemento, Neutralização ou Imunoensaios com Acs ou Ags marcados que utilizam sinalizadores da interação Ag-Ac com conjugados ligantes, como Imunofluorescência, Radioimunoensaio, Imunoenzimáticos, Imunofluorimétricos e Quimioluminiscência. É uma associação bimolecular semelhante à interação de enzimas com seus substratos ou de hormônios com seus receptores, com uma distinção bem evidente o Ac não provoca nenhuma alteração química irreversível na molécula de Ag, podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se dissociar nos seus 2 componentes; isto é, Ag e Ac livres /solução/suspensão. Ag + Ac AgAc (Imunecomplexos) 1

2 INTERAÇÕES Ag-Ac Reações reversíveis. Ligações não covalentes: -Pontes de hidrogênio -Interações hidrofóbicas -Interações de Van der Waals -Ligações iônicas RESPOSTA DE ANTICORPOS Especificidade Habilidade do Ac distinguir seu imunógeno de outros Ag. Quantidade N de células B x taxa de síntese do Ac x persistência após sua produção. Isotipo Determina a persistência (meia vida in vivo diferente). A composição determina a função dos Ac e os locais onde são encontrados. Afinidade Força de ligação do Ag com o Ac, em um único sítio. Quanto maior a afinidade entre Ac e Ag, menos Ac será necessário. Avidez: força total de ligação, nos dois sítios. Reações Cruzadas: É a habilidade de uma população de moléculas de Acs reagirem com mais de um Ag Avidez x Afinidade Reatividade Cruzada entre Ag-Ac É a habilidade de um Ac reagir através de seu parátopo com mais que um determinante antigênico. É a habilidade de uma população de moléculas de Acs reagirem com mais de um Ag 2

3 MÉTODOS SOROLÓGICOS MÉTODOS 1) Reagentes não marcados Reação de precipitação Reação de aglutinação 2) Reagentes marcados RIA ELISA Imunofluorescência Western Blotting Testes Imunocromatográficos PRECIPITAÇÃO - Imunodifusão dupla - Imunodifusão radial - Imunoeletroforese AGLUTINAÇÃO - Aglutinação direta e indireta - Inibição da aglutinação - Teste de Coombs IMUNOENSAIOS - RIA - ELISA - Imunofluorescência e Citometria de Fluxo - Western Blotting - Testes Imunocromatográficos APLICAÇÕES - Pesquisa - Diagnóstico - Soroepidemiologia PRECIPITAÇÃO X AGLUTINAÇÃO Precipitação: Formação de complexos Ag/Ac. Aglutinação: É o agrupamento de partículas antigênicas após a interação com Acs específicos, usualmente por moléculas de Acs que se ligam a Ags na superfície de partículas adjacentes. As reações de precipitação e de aglutinação decorrem, respectivamente da ligação entre o Ac e Ag solúveis ou particulados. REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO Interação entre Acs [IgG(*) e IgM(-)] e Ags solúveis Ac precisa ser bivalente ou c/ valência maior Ag precisa ser bi ou polivalente A reação pode ser afetada pelo n de sítios de ligação que cada Ac possui para seu Ag VALÊNCIA PRECIPITADO 3

4 É importante levar-se em conta como ocorre a ligação Ag-Ac em diferentes concentrações dos mesmos. Observe abaixo: TÉCNICAS DE PRECIPITAÇÃO EM GEL IMUNODIFUSÃO IMUNODIFUSÃO DUPLA Radial & Double Immunodiffusion As soluções sofrem difusão e, quando o Ag e o Ac se encontram em zona de equivalência, se observa a reação pela formação de uma linha de precipitação: Pode ser visualizada pós lavagem do gel, para remoção das proteínas solúveis, por coloração dos arcos de precipitação com corante 4

5 IMUNODIFUSÃO RADIAL IMUNOELETROFORESE Permite a quantificação do antígeno ou do anticorpo. O processo continua até ser atingida a zona de equivalência, com os complexos precipitandose em um anel (halo) em torno do orifício. Pode-se fazer comparação de misturas complexas de Ag que são separados em gel de agarose, pela aplicação de uma corrente elétrica. As moléculas migram para o pólo negativo, distribuindo-se no gel de acordo com os seus PM e cargas elétricas. Uma canaleta é recortada entre os poços e preenchida com Ac, que se difunde. Ag e Ac formam arcos de precipitação. 18 REAÇÕES DE AGLUTINAÇÃO Ac + Ag multivalente particulado Título: maior diluição que ainda causa aglutinação (semi-quantitativo) Pó-zona: excesso de Ac Potencial Zeta: alguns Ag podem apresentar carga elétrica (repulsão) Agregação visível de partículas = Eritrócitos, bactérias, fungos e látex AGLUTINAÇÃO DIRETA Células ou partículas insolúveis + Ac = Aglutinação Exemplo: tipagem sanguínea em lâminas (sistema ABO) 1) Amostra de sangue na placa teste: 2) Reagente (anticorpo anti A, B): 20 5

6 AGLUTINAÇÃO DIRETA 4) Mistura-se: AGLUTINAÇÃO DIRETA 5) Leitura do resultado: 3) Controle negativo: Um resultado positivo é indicado por uma aglutinação visível (aglomeração dos eritrócitos na placa teste), como ilustrado acima Hemaglutinação p/ determinação de grupos sanguíneos A, B e O. TESTE DE COOMBS Ac antiimunoglobulinas (Robert Coombs); DHRN mãe produz IgG anti-rh; Não aglutinam os eritrócitos; Direto: Ac ligados aos eritrócitos fetais; Indireto: Ac anti-rh não aglutinantes no soro materno. Permite detectar incompatibilidades Rh, prevenindo contra DHRN. 6

7 Aglutinação / Hemaglutinação Teste de aglutinação quantitativa Título: recíproca da > diluição com resultado + Efeito Prozona Aglutinação Passiva /Hemaglutinação Definição teste de aglutinação feito com um antígeno solúvel adsorvido a uma partícula (por ex. Cels./hemácias ou partículas de látex) (+) (-) Aplicações Medida de anticorpos para antígenos solúveis (por ex. Ags sols. do Toxoplasma gondii) AGLUTINAÇÃO INDIRETA (PASSIVA) Ag solúveis associados a outras superfícies (Partículas de látex ou superfície de hemácias) INIBIÇÃO DA AGLUTINAÇÃO Exemplo: presença de hcg na urina (gravidez) Exemplo: Hemaglutinação Passiva para a Doença de Chagas: As hemácias são revestidas com Ag do T. cruzi (ligação covalente) e então distribuídas nos poços da placa. O soro teste e os controles positivos e negativos, devidamente diluídos, são adicionados aos poços da referida placa. Se houver Ac específico contra o Ag, as hemácias se aglutinam e formam uma camada no fundo do poço. Quando não existe Ac específico, as células formam um botão no fundo do poço. Aglutinação Positiva Negativa Resultado negativo: (ausência de hcg na urina). Ocorre aglutinação, pois os anticorpos anti-hcg não são bloqueados na incubação inicial, porque não havia o hormônio na urina. Livres, podem aglutinar as partículas revestidas de hcg. 28 7

8 Aglutinação Bacteriana Aglutinação Bacteriana -As infecções bacterianas frequentemente induzem a produção de Acs séricos específicos para Ags de superfície das Bactérias. -A presença de tais Acs pode ser detectada pelas reações de aglutinação bacteriana. -Os títulos dos Acs séricos de um indivíduo suspeito é definido como a recíproca da maior diluição do soro que produz uma reação positiva de aglutinação. -O título aglutinante de um soro pode ser usado para o diagnóstico de infecções bacterianas. IMUNOENSAIOS IMUNOFLUORESCÊNCIA (IFA) Reagentes marcados (enzimas, fluorocromos, isótopos) Tipos: - RIA - ELISA - IFA / CITOMETRIA DE FLUXO - WESTERN BLOTTING - Testes Imunocromatográficos Princípio da técnica: Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível. Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa. A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência). Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina TRICT). Tipos: direta, indireta ou saduíche. 8

9 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA APLICAÇÃO DA IMUNOFLUORESCÊNCIA REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA IFA direta: Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais. IFA indireta: Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças autoimunes. É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais intensa) e especificidade. 9

10 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; simples execução; determinação de classes e subclasses de anticorpos Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da fluorescência sob irradiação; subjetividade na leitura; ausência de automação CITOMETRIA DE FLUXO CITOMETRIA DE FLUXO / APLICAÇÕES: Ferramenta que detecta e quantifica células individuais marcadas por fluorocromos, passando em uma corrente através de um feixe de Laser. Separa as células por fluorescência ativada. Cada anticorpo pode ser marcado com um fluorocromo diferente. É um teste qualitativo e quantitativo. APLICAÇÕES Tipo de população/subpop. de linfócitos/ leucócitos; Quantidade, tamanho, granulosidade; Isolamento de populações celulares; Monitoramento Cels TCD4 / CD8 - HIV Identificação e separação de células baseadas na dispersão de luz e fluorescência sob feixe de laser Estudo de populações de leucócitos luz dispersa tamanho e forma da célula Identificação de populações e/ou subpopulações de linfócitos T e B FACS (fluorescence-activated cell sorter) separação de uma única célula Barrientos et al.,

11 CITOMETRIA DE FLUXO Esquema de Funcionamento da Técnica CITOMETRIA DE FLUXO PREPARO DA AMOSTRA CITOMETRIA DE FLUXO PREPARO DA AMOSTRA CITOMETRIA DE FLUXO RESULTADOS Gating strategy to define lymphocyte subsets. (i) Histogram (univariate) plot of CD3 expression; this one-dimensional graph corresponds to a typical bar chart and is called histogram in flow cytometry. (ii) Pseudocolor plot of CD3 versus CD4. This display gives a better view on the distribution of CD3 expression than the histogram, in particular for **CD3 low expressing cells; note both axes are logarithmic, unlike the linear axes of scatter plots in Figure 2. (iii) Cartoon detailing interpretation of quadrant gates of (ii). CD3 + CD4 + cells are displayed in the top right quadrant (46.2% of lymphocytes). CD, cluster of differentiation. 11

12 IMUNOHISTOQUÍMICA / IMUNOCITOQUÍMICA TESTE DE IMUNOPEROXIDASE Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato incolor em produto colorido (deposição pode ser observada diretamente ao microscópio óptico) Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, - Galactosidase e Glicose Oxidase Método direto Acs primários conjugados (detecção de antígenos) Método indireto Acs secundários conjugados (detecção de antígenos ou anticorpos) Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamento inadequado dos conjugados Como são detectados / mensurados os níveis de Anticorpos em Fluidos Biológicos? Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA O teste detecta, identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. TÉCNICAS DE ELISA Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora). A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro. Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura. 12

13 TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto Para que o ELISA é usado:- -Mensurar os níveis de Acs específicos contra um determinado Ag e/ou microrganismo. -Detectar / Identificar vírus (Ags) -Mensurar hormônios -Mensurar marcadores de reações inflamatórias (citocinas, proteínas de fase aguda) PLACA UTILIZADA ELISA Indireto COMPETITIVE ELISA Ab Detection? ELISA Direto ou Sanduíche? 13

14 COMPETITIVE ELISA Ag Detection TESTES DE ELISA ( - ) (+) Aplicações do ELISA: Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo RADIOIMUNOENSAIO - RIA Marcações: I 125 : emite raios gama H 3 : raios beta Reprodutibilidade, especificidade e sensibilidade (em torno de 10-12g) Desvantagem a manipulação de isótopo radioativo. Aplicações: Triagem vírus da hepatite B em doadores de sangue, Hormônios, proteínas séricas, drogas, vitaminas e Ac. Pesquisa WESTERN BLOTTING Eletroforese de proteínas. Identifica antígenos ou anticorpos. 14

15 WESTERN BLOTTING WESTERN BLOTTING TESTE DE IMUNOCROMATOGRAFIA / IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA TESTE DE IMUNOCROMATOGRAFIA / IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA 15

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