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1 -Reações Sorológicas Para Doenças Reumáticas, Reações de Imunofluorescência e Diagnóstico Laboratorial do HIV- Prof. Esp. Jhonathan Rocha Goiânia, agosto/2014

2 Reações Sorológicas Para Doenças Reumáticas Doenças Reumáticas Grupo de Doenças do Tecido Conjuntivo (músculos, ossos, articulações) com caráter inflamatório e curso geralmente crônico. Reações Inflamatórias Localizadas ou Sistêmicas Inflamação Aguda x Inflamação Crônica Proteínas de Fase Aguda (PFA s)

3 Reações Sorológicas Para Doenças Reumáticas

4 Reações Sorológicas Para Doenças Reumáticas IL-a, IL-6, TNF-alfa

5 Avaliação Laboratorial das Proteínas de Fase Aguda Eletroforese de Proteínas Velocidade de Hemossedimentação (VHS) Dosagem de Proteína C Reativa (PCR) Proteína Soro Amilóide (SSA) Mucoproteínas/Alfa-1-Glicoproteína Ácida Proteínas do Sistema Complemento (CH50, C3, C4) Dosagem de Citocinas

6 Eletroforese - É um processo que consiste na separação dos componentes de um sistema através da aplicação de um campo elétrico; - É usado para separar e analisar biomoléculas; Princípio: Substâncias em solução que possuem carga elétrica livre, deslocam-se quando submetidas a um campo elétrico de sentido invariável.

7 Eletroforese -As moléculas são separadas umas das outras conforme o tamanho, a carga elétrica e a forma. - Separa-se partículas de mesma carga, porém com quantidades diferentes de carga. Moléculas grandes migram lentamente, enquanto moléculas pequenas movemse - Livre rapidamente. - Anticonvectante - Carga da partícula - ph (solução tampão) 7

8 Eletroforese de Proteínas Proteínas séricas: - Albumina - Globulinas (α1, α2, β, δ) - aminoácidos como eletrólitos

9 Eletroforese de Proteínas Métodos de Leitura Densitometria Densitometria 9

10 Velocidade de Hemossedimentação (VHS) -É a velocidade com que os eritrócitos se separam do plasma em uma unidade de Densitometria tempo ( 60 ou 120), agregando-se umas às outras e determinando a sedimentação. No sangue de indivíduos sadios, o efeito repulsivo das cargas positivas e negativas (Potencial Zeta) sobrepuja a força de atração e mantém as células suspensas; - Aumento de concentração de proteínas plasmáticas elevação do VHS. Método de Westergren Preconizado 10

11 Proteína C Reativa (PCR) -Aumenta no soro imediatamente após um dano tecidual e é um dos principais Densitometria testes empregados na diferenciação de doenças inflamatórias e não- inflamatórias e no acompanhamento terapêutico. Testes de Aglutinação Testes de Precipitação (Nefelometria e Turbidimetria) 11

12 Proteína Soro Amilóide (SAA) -É uma apolipoproteína sintetizada em resposta a citocinas liberadas de monócitos Densitometria e macrófagos que é capaz de clarificar os elementos inflamatórios e celulares lesados. Tem cinética semelhante à PCR. Enzimaimunoensaios 12

13 Mucoproteínas e Alfa-1-Glicoproteína Ácida -São glicoproteínas com alto teor de hexosaminas, assim denominadas pela sua propriedade de permanecer em solução no ácido perclórico a 0,6 M. Densitometria - Podem ser fracionadas e dentre as frações de interesse clínico estão: Alfa-1- Glicoproteína Ácida e a Alfa-2-Macroglobulina. Ensaio Colorimétrico (Bioquímica) Turbidimetria 13

14 Avaliação das Proteínas do Complemento -Processos Inflamatórios, Infecciosos e mediados por Imunoclomplexos Elevação das Proteínas do Complemento (CH50, C3 e C4) Densitometria - Algumas situaçãos levam ao consumo das proteínas dom complemento (ex. nefrite lúpica) Nefelometria Turbidimetria 14

15 Dosagem de Citocinas -Citocinas são potentes mediadores do processo inflamatório que podem determinar alterações locais e também manifestações sistêmicas; Densitometria - Podem ser detectadas no plasma, mas tem avaliação dificultada em decorrência da meia-vida curta e pela presença de fatores bloqueadores. Enzimaimunoensaios 15

16 Reações de Imunofluorescência Princípio da técnica: - Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível; - Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa; - A reação é feita em lâminas de microscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a observação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência); - Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluoresceína FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina TRICT). Tipos: direta ou indireta.

17 Imunofluorescência - Os testes de imunofluorescência são muito utilizados no diagnóstico de laboratório para a pesquisa de anticorpos e, com anticorpos monoclonais, para a pesquisa de micro-organismos e seus componentes antigênicos em espécimes clínicos; - Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno; - Fluorocromos são substâncias que, quando excitadas com luz de alta energia, absorvem luz de um comprimento de onda menor e, instantaneamente, emite luz de comprimento de onda maior (menor energia), fenômeno denominada fluorescência.

18 Imunofluorescência A Radiação UV do microscópio excita o fluorocromo presente no conjugado induzindo o fenômeno da Fluorescência. Presença de fluorescência na reação indica resultado positivo.

19 Tipos de Imunofluorescência

20 Imunofluorescência O resultado da IF é dado observando a presença de fluorescência (ex.: verde-maçã) para Soro Reagente e não fluorescente para Não Reagente; Imunofluorescência direta (IFD): é empregado na pesquisa e na localização de antígenos em células ou tecidos (do paciente) através de um anticorpo específico marcado com fluorocromo (conjugado vem no kit). O conjugado se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável. O anticorpo não ligado é removido por lavagens e o preparado é observado em microscópio de fluorescência; Imunofluorescência Indireta (IFI): Através deste método é possível saber a concentração de anticorpos séricos específicos para determinado antígeno por meio das diluições seriadas do soro, portanto é um método semiquantitativo ( o Ag vem na Lâmina). IFI: Título da reação Ag-Ac, última diluição onde houve reação.

21 Imunofluorescência Direta O teste de imunofluorescência direta é empregado na pesquisa e na localização de antígenos em células ou tecidos através de um anticorpo específico marcado com fluorocromo (conjugado). O conjugado se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável. O anticorpo não ligado é removido por lavagens e o preparado é observado em microscópio de fluorescência. O teste tem sido utilizado para a pesquisa de bactérias tais como: Chlamydia trachomatis, Treponema pallidum, Legionnella sp, Escherichia coli, Estreptococos ß-hemolítico do grupo A e vários vírus, com os do Herpes simples tipo 1 e 2, o Citomegalovírus, os da Influenza tipo A e B, os da Parainfluenza 1,2 e 3, o da Varicela-zoster e o Adenovírus.

22 Técnica de Imunofluorescência Direta As indicações desta técnica são: - Detecção de vírus, bactérias, parasitas (Ex.: Toxoplasma gondii), antígenos de células tumorais (imunofenotipagem tumoral) de amostras ou monocamadas de células do paciente (secreções, esfoliações, raspados teciduais, fragmentos teciduais de biópsia). - É utilizado também na identificação da distribuição de um antígeno no interior de um tecido ou compartimento de uma célula. - Detecta agentes infecciosos em secreções corporais, urina, fezes e em cortes histológicos.

23 Imunofluorescência Indireta (IFI) Ao incidir a luz violeta sobre o fluorcromo, as moléculas deste usam parte da energia para estabilizar sua energia interna, devolvendo para o meio a luz de cor verde maçã (comprimento de onda maior e de menor energia). Teste Sorológico

24 Microscópios de Fluorescência

25 Princípio da IFI Positivo Negativo Pesquisa de anticorpos no soro sanguíneo Imunofluorescência Indireta Uso de Anticorpo conjugado com FLUOROCROMO

26 Técnica de Imunofluorescência Indireta (IFI) Aplicações Clínicas: Medicina Humana Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas, tais como: doença de Chagas, AIDS, Hepatites, Citomegalovírus, Sífilis, Toxoplasmose, etc. Diagnóstico de doenças autoimunes. Medicina Veterinária Diagnóstico de Toxoplasmose, Neosporose, Raiva, Campilobacteriose, etc.

27 IFI T. cruzi IFI T. pallidum (FTA-ABs) IFI T. gondii Imunofluorescência Testes Sorológicos

28 Aplicações das Técnicas de Imunofluorescência IFA direta: Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais. IFA indireta: Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças autoimunes. É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade (fluorescência é mais intensa) e especificidade.

29 Enzimaimunoensaio - EIA São técnicas que permitem medidas quantitativas diretas da interação antígeno-anticorpo por medida da atividade enzimática sobre um substrato. Reagentes Utilizados: Suporte sólido (poliacrilamida, poliestireno) Diluente de amostra (Tween 20, PBS) Conjugados (Anticorpo marcado com enzima) Substratos cromogênicos (OPD e TMB)

30 ENZIMAIMUNOENSAIO ELISA Constitui um grupo de diferentes ensaios laboratoriais imunoenzimáticos capazes de determinar a quantidade do analito de interesse em uma amostra biológica (um anticorpo específico ou um determinado antígeno).

31 ENZIMAIMUNOENSAIO ELISA - SOROLOGIA ELISA INDIRETO SANDUICHE DE ANTICORPO ELISA DIRETO SANDUICHE DE ANTÍGENO Ac de Captura

32 Ensaio Imunoadsorvente Ligado à Enzima - ELISA - O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas. Fosfatase alcalina Peroxidase B-galactosidase - O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora). - A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro ou espectrofotômetro. - Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche Ag, competição e captura.

33 ELISA Aplicação: Testes de sorológicos - pesquisa de anticorpos ou antígenos séricos. Princípio: um dos reagentes (o antígeno ou o anticorpo específico) é imobilizado em um suporte sólido (placa), a amostra sérica deverá ser adicionada nas cavidades da placa para se proceder a pesquisa do analito de interesse. A presença do analito na reação induz formação de imunocomplexos, os quais serão demonstrados através da interação específica de um conjugado marcado com uma enzima (ex.: peroxidase), a adição subseqüente de um substrato cromogênico (ex.: DAB + H 2 O 2 ) indica reação entre antígeno e anticorpo específico e forma, no final da reação, um produto corado capaz de ser medido fotometricamente, o resultado é dado em densidade óptica (D.O.). Significado Clínico: Diagnóstico de diversas doenças infecciosas, detecção de antígenos séricos, dosagem de anticorpos específicos, avaliação da resposta imune específica humoral a certo patógeno. Cálculos / Cut-off

34 TIPOS DE ELISA: Direto e Indireto INDIRETO DIRETO OU SANDUÍCHE PLACA UTILIZADA

35 ELISA Indireto ELISA Direto ou Sanduíche

36 ELISA Competitivo AC do Kit é marcado Reação Negativa = COR Aplicações do ELISA: Testes de rotina em Laboratórios Clínicos e de Pesquisa Vantagens: Teste de alta sensibilidade Permite quantificar Ag ou Ac das amostras Seguros e de baixo custo

37 ELISA Vantagens e Desvantagens: Sensibilidade, especificidade e simplicidade da técnica; Cuidados com interferentes, reações cruzadas; Versatilidade, rapidez, baixo custo e objetividade da leitura; Erros operacionais, variáveis analíticas; Adaptação a diferentes graus de automação; Instabilidade dos reagentes; Influência em manipulações e do equipamento.

38 Diagnóstico Laboratorial do HIV HIV-1 e 2

39 Diagnóstico Laboratorial do HIV PORTARIA Nº 151, DE 14 DE OUTUBRO DE 2009 Diagnóstico sorológico da infecção pelo HIV deve ser realizado em indivíduos com idade acima de 18 meses, resolve: Art. 1º Aprovar, na forma dos Anexos a esta Portaria, etapas sequenciadas e o Fluxograma Mínimo para o Diagnóstico Laboratorial da Infecção pelo HIV em indivíduos com idade acima de 18 (dezoito) meses, de uso obrigatório pelas instituições de saúde públicas e privadas; Art. 2º Determinar o uso dos testes rápidos para o diagnóstico da infecção pelo HIV em situações especiais, conforme disposto no Anexo II a esta portaria (difícil acesso, CTA, segmentos vulneráveis, acidentes biológicos ocupacionais, gestantes não-testadas, entre outros);

40 Diagnóstico Laboratorial do HIV Art. 3º Definir que as amostras podem ser de soro, plasma, sangue total ou sangue seco em papel filtro e devem ser coletadas em conformidade com o que é preconizado pelo fabricante do teste a ser utilizado; Parágrafo Único. Fica vedada a mistura de amostras (pool) para a utilização em qualquer teste laboratorial, com o objetivo de diagnosticar a infecção pelo HIV; Art. 4º Estabelecer que todos os reagentes utilizados para o diagnóstico da infecção pelo HIV devem ter registros vigentes na Agência Nacional de Vigilância Sanitária, de acordo com o disposto na Resolução RDC nº. 302/ANVISA, de 13 de outubro de 2005, suas alterações, ou outro instrumento legal que venha a substituí-la;

41 Diagnóstico Laboratorial do HIV Art. 5º O Ministério da Saúde, por intermédio do Departamento de Vigilância, Prevenção e Controle das Doenças Sexualmente Transmissíveis e Síndrome da Imunodeficiência Adquirida, da Secretaria de Vigilância em Saúde, do Ministério da Saúde - DDSTAIDS/SVS/MS, definirá as normas técnicas necessárias aos programas de validação de reagentes para uso no diagnóstico da infecção pelo HIV. (

42 Diagnóstico Laboratorial do HIV Fluxograma: - Duas amostras distintas, em caso de uma primeira positiva. Repetir com duas metodologias diferentes, ou, quando da mesma metodologia, por princípios diferentes; - Testes sorológicos de triagem baseiam-se na pesquisa de anticorpos contra componentes estruturais do vírus HIV (imunocromatografia, Elisa, IFI, ensaios luminescentes, western blot); - Pode-se também realizar a pesquisa do antígeno (técnicas moleculares Ex. PCR).

43 Imunocromatografia A imunocromatografia é uma técnica que começou a ser desenvolvida nos anos 60, sendo primeiro criada para o estudo das proteínas séricas; Atualmente para a detecção de muitas doenças infecciosas: Dengue, malária, amebíase, brucelose, giardíase, leishmaniose visceral, hepatite B, infecção por HIV, Helicobacter pylori, Streptococcus pneumoniae, entre outras; De grande valor em situações nas quais os profissionais de saúde necessitam tomar decisões e assumir condutas imediatas.

44 Características Qualitativos; Teste de triagem; Rápido; Econômico; Fácil interpretação; Leitura é feita a olho nu; Apresenta sensibilidade e especificidade similares ao ELISA.

45 Princípio Utilizada uma matriz de membrana de nitrocelulose ligada a uma tira de acetato transparente; Para detectar antígeno, emprega-se um anticorpo de captura, ligado à matriz e um anticorpo marcado específico ao antígeno pesquisado; Para detectar anticorpo, utiliza-se um antígeno específico ligado à matriz e um anticorpo anti-imunoglobulina marcado;

46 Princípio Para detecção de antígenos podem ser utilizados anticorpos fixados na linha de captura e como conjugado um segundo anticorpo conjugado ao corante. Um dos métodos imunológicos desses testes emprega corante insolúvel, como ouro coloidal (róseo) ou prata coloidal (azul marinho) como revelador da interação antígeno-anticorpo.

47 Imunomigração Rápida

48 Imunomigração Rápida

49 Imunomigração Rápida

50 Interpretação

51 POSITIVO: Duas linhas são visíveis, sendo uma linha na região controle (C) e outra na região teste (T). A intensidade de cor da linha teste (T) poderá variar de acordo com a concentração presente na amostra. Todavia, qualquer intensidade de cor na linha teste indica resultado positivo. NEGATIVO: Apenas uma linha é visível na região controle (C), não sendo observada linha na região teste. INVÁLIDO: Não é evidenciada a linha controle (C). As razões mais comuns de falha são o volume insuficiente de amostra ou falha no procedimento técnico. Neste caso, reler a técnica e repetir o teste com uma nova tira.

52 Imunomigração Rápida

53 Western blotting Método que combina a eletroforese em gel com ensaio imunoenzimático numa membrana (membrana de nitrocelulose). Etapas: 1) Obtenção do antígeno a ser testado no ensaio laboratorial (Ex:.proteínas bacterianas, virais, fúngicas, protozoários, helmintos, etc.); 2) Eletroforese das proteínas antigênicas (separação por massa molecular), migração das moléculas no campo elétrico. 3) Transferência dos antígenos do gel para a membrana de nitrocelulose. 4) Reação imunoenzimática para testar os soros de interesse, antígenos já estão presentes na membrana de nitrocelulose.

54 Western blotting Eletroforese de proteínas. Identifica antígenos ou anticorpos na amostra (reação imunoenzimática).

55

56 Western blotting

57 Pesquisa de Anticorpos Séricos Anti-HIV-1

58 APLICAÇÕES CLÍNICAS DO WESTERN BLOTTING Confirmação do diagnóstico pelo HIV (pesquisa de anticorpos anti- HIV); Pesquisa de antígenos ou de anticorpos específicos em outras doenças infecciosas; Diagnóstico de Hepatite B; Diagnóstico de Hepatite C; Diagnóstico de Dengue; Diagnóstico de HTLV.

59 Acompanhamento Laboratorial da Evolução do HIV Carga Viral HIV RT-PCR Genotipagem HIV Avaliação CD4/CD8 Acs Monoclonais

60 Acompanhamento Laboratorial da Evolução do HIV

61 Levando-se em consideração a importância da determinação da quantidade de células CD4+ em pacientes HIV positivos, é correto afirmar: a)não deve ser realizada em um paciente com AIDS com o objetivo de indicar o tratamento, mas sua utilização é muito importante para avaliar a resposta ao antirretroviral. b) deve ser realizada antes do tratamento para monitorar o sistema imune do paciente e nos casos em que o paciente apresente menos de 350 células/ml, onde o tratamento está indicado independentemente da presença de sintomas. c) deve ser realizada antes do tratamento para monitorar o sistema imune do paciente e no caso em que o paciente apresente menos de 350 células/ml, onde o tratamento está indicado apenas se o paciente apresentar sintomas. d)deve ser realizada antes do tratamento para monitorar o sistema imune do paciente, mas o tratamento só está indicado para paciente com carga viral maior que cópias/m, independente da contagem de células CD4. C

62 D A sequência correta que define o diagnóstico inicial de um paciente com infecção pelo HIV está descrita na alternativa: a) Dosagem inicial do provírus (HIV DNA) e contagem de células CD4. Com a dosagem do provírus tendo que estar positiva e as células CD4 abaixo de 250 células/ml. b) Apenas um teste positivo para HIV pelo método de ELISA é suficiente para se concluir o diagnóstico, não havendo necessidade de outros testes. c) Dosagem inicial do provírus (HIV DNA) e determinação da carga viral (HIV RNA). d) No caso de um teste positivo para HIV pelo método de ELISA, é obrigatória a realização de um novo teste para HIV pelo método de ELISA, porém, com uma nova amostra de sangue; e caso esse segundo também seja positivo, deve-se proceder à pesquisa por Western blot para confirmação da infecção.

63 Dentre as alternativas abaixo, assinale aquela que melhor explica a usual resistência do vírus HIV aos antirretrovirais: a) O HIV apresenta uma RNA polimerase com baixa fidelidade que leva à incorporação de mutações dispersas pelo seu genoma. b) O HIV se replica pelo mecanismo de 'rolling-circle', gerando múltiplas cópias de RNA que se combinam ao acaso. c) O HIV apresenta um padrão Lamarckiano de mutações, desenvolvendo as mutações de resistência para o antirretroviral utilizado. d) O HIV apresenta uma transcriptase reversa com baixa fidelidade, que leva à incorporação de mutações dispersas pelo seu genoma. D Drogas Inibidoras de Transcriptase Reversa

64 A contagem diferencial de linfócitos T auxiliadores por citometria de fluxo é principalmente utilizada para: a)avaliação da resposta imunitária após vacinação. b) Avaliação da evolução da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS). c) Estimativa do potencial auxiliador destes linfócitos para a resposta humoral. d) Avaliação de quadro de septicemia aguda. e) Substituir a contagem manual, pois não é possível realizar esta contagem por microscopia. B

65 Só conheço uma liberdade, e essa é a liberdade do pensamento. Antoine de Saint-Exupéry Bons Estudos!

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