Discente: Ketherson Rodrigues Silva Orientador: Prof. Dr. Hélio José Montassier

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1 Discente: Ketherson Rodrigues Silva Orientador: Prof. Dr. Hélio José Montassier

2 IMUNODIAGNÓSTICO: Diagnóstico laboratorial por meio de técnicas imunológicas. Busca: Anticorpo ou Antígeno no organismo vertebrado suspeito de estar infectado usando-se ensaios de Precipitação, Aglutinação, Fixação de complemento, Neutralização ou Imunoensaios com Acs ou Ags marcados que utilizam sinalizadores da interação Ag-Ac com conjugados ligantes, como Imunofluorescência, Radioimunoensaio, Imunoenzimáticos, Imunofluorimétricos e Quimioluminiscência Outros testes: Hipersensibilidade a Antígenos: Reações intradérmicas e percutâneas (Testes in vivo).

3 É uma associação biomolecular semelhante à interação de enzimas com seus substratos ou de hormônios com seus receptores, com uma distinção bem evidente o Anticorpo não provoca nenhuma alteração química irreversível na molécula de Ag, podendo, portanto, o produto formado (Ag-Ac) se dissociar nos seus 2 componentes Ag e Ac livres /solução/suspensão. Ag + Ac AgAc (Imunecomplexos)

4 A interação entre Ag e Ac envolve a ocorrência de várias forças não covalentes entre o determinante antigênico (epítopo) da molécula do Ag e o sítio combinatório (parátopo) da molécula do Ac, constituído pelas regiões (domínios) variáveis de cadeia L e de cadeia H (VL / VH) e particularmente pelas regiões hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs) de VH e de VL.

5 A elevada especificidade das interações Ag e Ac possibilitou: 1) O desenvolvimento de uma grande variedade de ensaios ou reações sorológicas 2) As reações sorológicas podem detectar / identificar / mensurar tanto Ags como Acs.

6 3) As reações sorológicas revestem-se de uma enorme importância para: 3.1) O diagnóstico laboratorial de enfermidades infecciosas 3.2) O monitoramento da intensidade de respostas humorais pós-vacinação e também para detectar / mensurar / identificar imunoquimicamente moléculas de interesse biológico ou médico 4) Os ensaios sorológicos podem diferir em parâmetros como limiar de detecção, sensibilidade, especificidade, reprodutibilidade e alguns podem ser quantitativos enquanto outros são qualitativos.

7 ENSAIOS SOROLÓGICOS Primários detectam a interação direta entre antígeno e anticorpo: Ex. Radioimnoensaio, Imunofluorescência, ELISA Secundários detectam conseqüências da interação entre antígeno e anticorpo mudanças no estado físico do antígeno: Imunodifusão, Aglutinação, Fixação de Complemento. Ac + Ag K 1 K 2 Ac-Ag K 1 = M -1 alta afinidade Van Oss, 2000; Janeway, 2001

8 Metodologias que utilizam reagentes não marcados: Precipitação Aglutinação Hemólise (Fixação de Complemento) Metodologias que utilizam reagentes marcados: Radioimunoensaios ELISA Imunofluorescência Western Blotting Citometria de Fluxo.

9 Conceito de chave e fechadura Ligações não-covalentes Pontes de Hidrogênio Ligações Eletrostáticas Forças de Van der Waals Ligações Hidrofóbicas Ligações Múltiplas Reversível Source: Li, Y., Li, H., Smith-Gill, S. J., Mariuzza, R. A., Biochemistry 39, 6296, 2000

10 Alta Afinidade Ac Afinidade Refere-se à força da interação entre um determinante antigênico e o parátopo de um Ac homólogo. baixa Afinidade Ac Ag O complexo Ag-Ac tende a se manter unidos Ag Os complexo Ag-Ac tende a se dissociar

11 Ag + Ac Ag-Ac Aplicando a Lei de Ação de Massa K = [AgAc] [Ag] x [Ac]

12 Avidez A força total de ligação entre um Ag com vários determinantes e Acs multivalentes. K eq = 10 4 Afinidade 10 6 Avidez Avidez

13 É a habilidade de um anticorpo reagir por meio do seu sitio combinatório com somente um determinante antigênico Outros autores definem: É a habilidade de uma população de moléculas de anticorpos reagirem fortemente com um antígeno e fracamente com outro Ag de estrutura semelhante.

14 Reatividade Cruzada É a habilidade de um Ac reagir através de seu parátopo com mais que um determinante antigênico. É a habilidade de uma população de moléculas de Acs reagirem com mais de um Ag Reações cruzadas Anti-A Ac Anti-A Ac Anti-A Ac Ag A Ag B Epítopo compartilhado Ag C Epítopo similar

15 Fatores que Afetam as Reações Ag/Ac Afinidade Avidez Relação [Ag]:[Ac] Forma física do Ag (solúvel ou particulado) Excesso de Ac Excesso de Ag Equivalência formação de rede

16 Fig Different antibodies bind to distinct epitopes on an antigen molecule.

17 Todos os testes baseados nas reações Ag/Ac dependerão da formação de rede ou eles terão de utilizar outras vias para detectar pequenos complexos imunes Todos testes baseados nas reações Ag/Ac podem ser usados para detectar o Ag ou Ac

18 SINAL X RUÍDO SINAL Resultado da integração de impulsos elementares oriundos da reação do anticorpo com o seu epítopo É de natureza variável segundo a técnica utilizada.

19 SINAL X RUÍDO RUÍDO Qualquer reatividade inespecífica resultante de outras causas, que não a reação antígeno-anticorpo, e que pode interferir na capacidade discriminativa do teste sorológico.

20 LIMIAR DE DETECÇÃO DE UM TESTE SOROLÓGICO Menor número de impulsos elementares necessários para o desenvolvimento de um sinal discriminatório, correspondendo a um resultado positivo

21 Fatores que afetam a medição de reações antígeno-anticorpo 1. Afinidade Quanto maior a afinidade do Ac pelo Ag, mais estável será a interação. Nesse caso, a facilidade com que se pode detectar a interação é maior 2. Avidez Reações entre antígenos multivalentes e anticorpos multivalentes são mais estáveis e portanto mais fáceis de detectar 3. Razão entre antígeno e anticorpo A razão entre o antígeno e o anticorpo influencia a detecção dos complexos antígeno-anticorpo porque o tamanho dos complexos está relacionado com a concentração do antígeno e do anticorpo 4. Forma física do antígeno A forma física do antígeno influencia em como se detecta a reação AgAc. Se o Ag é particulado, geralmente se observa a aglutinação do Ag pelo Ac. Se o Ag é solúvel, geralmente se pesquisa a precipitação de um antígeno após a produção de grandes complexos AgAc insolúveis.

22 LIMIAR DE DETECÇÃO OU SENSIBILIDADE ANALÍTICA DE ALGUMAS REAÇÕES SOROLÓGICAS TESTES DE LIGAÇÃO PRIMÁRIA TESTES DE LIGAÇÃO SECUNDÁRIA RIE 0,00005 g/ml HEMAGLUT. PASSIVA 0,01 g /ml ELISA 0,0005 g/ml RFC 0,05 g/ml AGLUT. BACTÉRIAS 10,05 g /ml PRECIPITAÇÃO GEL 30,00 g/ml

23 Formação de rede

24 3) Testes de Aglutinação: simples, baratos, um pouco mais sensíveis! Existem Vários Tipos: a) Hemaglutinação dos Eritrócitos b) Aglutinação Bacteriana c) Aglutinação Passiva d) Inibição da Aglutinação (Inib. Hemaglutinação HI)

25 Determinação de Grupos Sanguíneos Sistema ABO

26 Aglutinação/Hemaglutinação Definição - testes que têm como seu ponto final a aglutinação de um antígeno de natureza particulado (células procarióticas ou eucarióticas) Acs: Aglutinina/hemaglutinina, principalmente do isótipo IgM* e IgG Teste de aglutinação qualitativa Podem ser pesquisados Ag ou Ac (*Via de regra é o Ag, Ex; tipagem de grupos sanguíneos) +

27 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 Aplicações Tipagem de sangue Infecções Bacterianas Considerações Práticas Fácil Semi-quantitativo

28 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 Pos. Neg. Teste de aglutinação quantitativa Título: recíproca da > diluição com resultado + Efeito Prozona Paciente Título <

29 4. Agglutination Reactions -visible clumping by interaction between Ab & a particulate antigen suchas RBC, latex beads. -depend on the crosslinking of polyvalent antigens, similar to precipitation rxns (lgm is a good agglutinin) -provide a way to type bacteria with a panel of typing antisera. -routinely performed to type RBCs for blood transfusion (control) FIGURE 6-7 Demonstration of humaglutination using Ab against sheep red blood cells (SRBCs): a constant # of SRBCs plus serial two-fold dilutions of anti-srbc serum

30 Definição teste de aglutinação feito com um antígeno solúvel adsorvido a uma partícula (por ex. Cels./hemácias ou partículas de látex) + Aplicações Medida de anticorpos para antígenos solúveis (por ex. Ags sols. do Toxoplasma gondii)

31 Aglutinação Passiva As particulas são revestidas com Ags, Partículas mais usadas Eritrócitos, látex, bentonita ou carvão.

32 -Aglutinação Bacteriana -As infecções bacterianas frequentemente induzem a produção de Acs séricos específicos para Ags de superfície das Bactérias. -A presença de tais Acs pode ser detectada pelas reações de aglutinação bacteriana. -Os títulos dos Acs séricos de um indivíduo suspeito é definido como a recíproca da maior diluição do soro que produz uma reação positiva de aglutinação. -O título aglutinante de um soro pode ser usado para o diagnóstico de infecções bacterianas.

33 Um exemplo de teste de soroaglutinação com partículas é o teste de Látex de aglutinação ou de aglutinação bacteriana. Acs Anti-bacterianos Ag Bacteriano (+) (-)

34 Testes de Precipitação - Formação de rede - Tipo de Ags: Macromoléculas Solúveis - Principais Acs envolvidos: IgG* e IgM - Formação de Precipitado dos Imunocomplexos - Maior formação de precipitado de imunecomplexos na zona de equivalência entre as concentrações de Ag e de Ac

35 1. Reações de Precipitação: -Acs e Ags em soluções aquosas formam uma rede/malha => Precipitação A formação da rede requer: 1) Acs polivalentes 2) Ags devem ser bivalentes / polivalentes Precipitação + Não Precipitação Testes de Precipitação: simples, baratos, mas específicos! e pouco sensíveis!!!

36 Reação de Imunodifusão em Gel de Ágar

37 TESTE DE LIGAÇÃO SECUNDÁRIA Nem todo anticorpo que reagiu participa da geração de sinal Sensibilidade analítica = 30 µg / ml TESTE DE ELEVADA ESPECIFICIDADE ANALÍTICA BAIXÍSSIMA OCORRÊNCIA DE RUÍDO TESTE DE EXECUÇÃO SIMPLES BAIXO CUSTO

38 CURVA DE PRECIPITAÇÃO QUANTITATIVA EM MEIO LÍQUIDO ANTÍGENOS SOLÚVEIS

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40 Curva de Precipitação

41 FATORES QUE AFETAM A DIFUSÃO CONCENTRAÇÃO D=K x C TEMPERATURA D=K x T PESO MOLECULAR D=K x 1/PM FORMATO MOLÉCULA D=Maior moléculas esféricas VISCOSIDADE DO MEIO D= K x 1/V TAMANHO DO PORO (gel) D=K x DIAM. PORO

42 40 µl soro ou antígeno 4,5 ml GEL 1% LÂMINA 24 X 76 mm ORIFÍCIO NO GEL 5 mm Diâmetro

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44 ONDA DE DIFUSÃO

45 40 µl antígeno 40 µl soro

46 40 µl antígeno 40 µl soro

47 40 µl antígeno 40 µl soro Antígeno e Anticorpo encontrando-se em proporções ótimas

48 in the Ab-containing semisolid medium 3. Precipitation Reactions -> The area is proportional to the conc. of Ag. The region of equivalence FIGURE 6-5 Diagrammatic representation of radial & double immunodiffusion. : precipitation reactions in gels yield visible precipitin lines; no visible precipitate forms in regions of Ab or Ag excess.

49 Técnica de Imunodifusão Dupla em Gel deágar - IDGA

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51 IDENTIDADE TOTAL SOROS ANTI- A ANTÍGENO A

52 IDENTIDADE TOTAL ANTÍGENOS ANTÍGENO- A anti- A

53 IDENTIDADE PARCIAL SOROS anti - A anti - AB ANTIGENO AB

54 IDENTIDADE PARCIAL ANTÍGENOS ANTÍGENO A ANTÍGENO AB anti- AB

55 NÃO IDENTIDADE DE SOROS anti- A anti- B ANTÍGENOS A + B

56 NÃO IDENTIDADE DE ANTÍGENOS ANTÍGENO A ANTÍGENO B anti- A + anti B

57 -Formação de rede -Tipo de Ags: Macromoléculas Solúveis -Principais Acs envolvidos: IgG e IgM -Formação de Precipitado dos Imunocomplexos -Maior formação de precipitado de imunecomplexos na zona de equivalência entre as concentrações de Ag e de Ac

58 Fig IDGA IMUNODIFUSÃO DUPLA EM GEL DE ÁGAR - Ouchterlony geldiffusion assay for antigen:antibody binding. Antigen and antibody are placed in different wells of an agar gel. They diffuse toward each other and precipitate where they meet at equivalence, forming a visible band. When serum samples in two wells are tested against the same well of antigen, the relatedness of the samples can be determined by the shape of the precipitin line formed (not shown).

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60 Método Interpretação Qualitativa Concentração relativa

61 Método Ags sâo separados por eletroforese + Ac é colocado dentro do agar cortado Ag - Ag Ac Ag Ac Interpretação Precipitina representam os antígenos individuais

62 Fig Immunoelectrophoresis reveals the presence of several distinct immunoglobulin isotypes in normal human serum.

63 Método Ag e Ac migram em direção ao outro pela eletroforese Usado somente quando o Ag e o Ac têm cargas opostas - + Ag Ac Qualitativa Rápida

64 Ensaios Baseados no Complemento

65 Fixação de Complemento Metodologia Ag misturado com soro teste para ser ensaiado pelo Ac Quantidade padrão de complemento é adicionado Eritrócitos cobertos com Acs é adicionado Determinação da quantidade de eritrócitos lisados Ag Sem Ag Ag Ag Soro de paciente

66 LIMIAR DE DETECÇÃO