Imunocromatografia e Dot-ELISA. Responsável Prof. Helio J. Montassier

Transcrição

1 Imunocromatografia e Dot-ELISA Responsável Prof. Helio J. Montassier

2 IMUNOCROMATOGRAFIA A imunocromatografia é uma técnica que começou a ser desenvolvida nos anos 60, sendo primeiro criada para o estudo das proteínas séricas; Atualmente é usada para o imuno-diagnóstico de muitas doenças infecciosas: Dengue, malária, amebíase, peste bubônica, brucelose, giardíase, leishmaniose visceral, hepatite B, infecção por vírus como HIV, cinomose, parvovirose, coronavirose, Helicobacter pylori, Streptococcus pneumoniae, entre outras; sendo usado ou para a detecção de Ags ou de Acs. De grande valor em situações mais simples de trabalho e nas quais os profissionais de saúde necessitem tomar decisões e assumir condutas mais rápidas.

3 Características Qualitativos; Teste de triagem; Rápido; Econômico; Fácil interpretação; Leitura é feita a olho nu; Apresenta sensibilidade e especificidade similares ao ELISA de terceira geração;

4 Princípio Utiliza uma matriz de membrana de nitrocelulose ligada a uma tira de acetato transparente; Para detectar antígeno, emprega-se um anticorpo de captura, ligado à matriz e um anticorpo marcado com partículas coloridas que é específico para o antígeno pesquisado; Para detectar anticorpo, utiliza-se um antígeno específico ligado à matriz e um anticorpo antiimunoglobulina marcado com partículas coloridas;

5 Princípio Para detecção de antígenos podem ser utilizados anticorpos fixados na linha de captura e como conjugado um segundo anticorpo conjugado a partículas coloridas. Um dos métodos imunológicos desses testes emprega partículas coradas, como ouro coloidal (róseo) ou prata coloidal (azul marinho) como revelador da interação antígeno-anticorpo.

6 IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

7 IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

8 IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA NASA

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10 POSITIVO: Duas linhas são visíveis, sendo uma linha na região controle (C) e outra na região teste (T). A intensidade de cor da linha teste (T) poderá variar de acordo com a concentração do analito (Ag / Ac) presente na amostra. Todavia, qualquer intensidade de cor na linha teste indica resultado positivo. NEGATIVO: Apenas uma linha é visível na região controle (C), não sendo observada linha na região teste. INVÁLIDO: Não é evidenciada a linha controle (C). As razões mais comuns de falha são o volume insuficiente de amostra ou falha no procedimento técnico. Neste caso, reler a técnica e repetir o teste com uma nova tira.

11 IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

12 FIV e FeLV Vírus da Imunodeficiência Felina (FIV) e Vírus da Leucemia Felina (FELV)

13 Kit teste - vírus da cinomose Detecção de Ag do vírus da cinomose; Amostra: mucosa nasal, conjuntiva, saliva, urina, soro e plasma; Kit: diluente, swab esterilizado, conta-gotas (pipeta) e dispositivo teste; Materiais necessários não fornecidos: solução salina e cronômetro.

14 Kit teste - vírus da cinomose Soro ou plasma: 2 ou 3 gotas no diluente 300µL

15 Kit teste - vírus da cinomose Quando o teste começar a reagir, deve-se observar uma cor rosa se movendo através da janela de resultado no centro do dispositivo de teste. Se esta não for visualizada após 1 minuto, adicionar mais uma gota da amostra + diluente no orifício; Interpretar o resultado do teste entre 5 e 10 minutos. Não interpretar o resultado em um tempo superior a 12 minutos.

16 Kit teste - vírus da cinomose

17 Kit teste - vírus da cinomose

18 Kit teste - vírus da cinomose

19 Kit teste - vírus da cinomose Reação Cruzada

20 Kit teste - vírus da cinomose Observações Testar a amostra imediatamente após a coleta; Se a amostra não for testada imediatamente, manter sob refrigeração (2 a 8º C), por 48 horas; Se for necessário um armazenamento de vários dias, é recomendado o congelamento (-20ºC).

21 Kit teste Anticorpos contra o vírus da cinomose Detectar anticorpos contra o virus da cinomose Amostras: sangue, plasma ou soro

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23 Kit teste Anticorpos contra o vírus da cinomose

24 Kit teste Anticorpos contra o vírus da cinomose LIMITAÇÕES Resultados falso-positivos Animais recémvacinados; Resultados falso-negativos animais imunossupremidos;

25 Kit teste Vírus da Parvovirose e Coronavirose O teste deve ser realizado utilizando fezes caninas frescas. Se a amostra não for testada imediatamente, manter sob efrigeração (2 a 8º C) por até 48 horas.

26 Detecção do Vírus da Raiva pelo Teste Imunocromatográfico

27 Detecção do Vírus da Raiva pelo Teste Imunocromatográfico

28 Detecção do Vírus da Raiva pelo Teste Imunocromatográfico

29 Detecção de Acs contra o vírus da dengue

30 Detecção de Gonadotrofina Coriônica Humana (GCH) Pode ser detectado no soro partir do 7º dia de gestação; Duplica a concentração a cada 2 dias. Qualquer urina do dia; Princípios: - Conjugado: Ac anti-gch + partículas coradas - Anticorpo de captura

31 1 gota de urina Detecção de GCH

32 IMMUNO-DOT DOT-ELISA reação imunoenzimática sobre membranas Qualitativa ou semi-quantitativa: rápida r e simples Proteínas solúveis, fungos, protozoários, rios, bactérias e vírusv Stott, 2000

33 Para a realização deste teste, utilizam-se sistemas enzimáticos com proteína A, ligada a corantes específicos, também denominados Dot-ELISA. Ele é realizado em papéis, o que possibilita sua utilização em áreas endêmicas, pois dispensa etapas críticas de incubação e leitura ótica (FERREIRA & ÁVILA, 2001; MANCIANTI et al., 1996)