INSTRUÇÕES DE TRABALHO
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- Vagner Braga Filipe
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1 INSTRUÇÕES DE TRABALHO Versão: Pag.: 1 de 5 1. FINALIDADE DO MÉTODO 1.1 A detecção de anticorpos específicos contra infecção pelo vírus do dengue. Anticorpos do tipo IgM são encontrados na infecção primária e secundária, sendo detectados títulos mais baixos ou ausentes na infecção terciária. Anticorpos do tipo IgG são menos específicos, podem advir de transferência vertical materna à criança ou serem positivos após vacinação contra febre amarela, mas sua dosagem é importante em áreas endêmicas, pois partes dos pacientes reinfectados podem não apresentar aumento dos níveis de IgM. 1.2 O DENGUE IgM e IgG é um teste imunocromatográfico em fase sólida para a detecção rápida, qualitativa e diferencial de anticorpos IgG e IgM para o vírus da dengue em soro, plasma humano ou sangue total. Este teste destina-se ao uso profissional como um recurso do diagnóstico presuntivo entre a infecção primária e secundária da dengue. 1.3 O isolamento do vírus, detecção de antígeno em tecidos fixados, RT-PCR e teste sorológico como o teste de hemaglutinação-inibição, métodos de diagnósticos mais específicos e alternativos devem ser utilizados de modo a obter uma confirmação da infecção pelo vírus da dengue. 2. PRINCÍPIO DO MÉTODO 2.1 O dispositivo DENGUE IgM e IgG Alere-Bioeasy contém três linhas prérevestidas em sua superfície, a linha de Teste (G), a linha de Teste (M) e a linha Controle (C). Todas as três linhas não são visíveis na janela de resultados antes da aplicação da amostra. 2.2 A linha Controle (C) é utilizada para o controle do procedimento. A linha Controle (C) deve sempre aparecer se o procedimento do teste for realizado adequadamente e os reagentes da linha controle estiverem funcionando. 2.3 Quando uma amostra é adicionada ao dispositivo, anticorpos IgG e IgM anti- Dengue presentes na amostra irão reagir com as proteínas recombinantes do envelope viral do vírus da dengue do conjugado ouro coloidal e formarão um complexo de anticorpos e conjugado ouro coloidal. À medida que esta mistura migra ao longo do teste por ação capilar, o complexo anti dengue IgG ou IgM é capturado pelas IgG eóu IgM anti-humanas imobilizadas nas duas linhas ao longo da tira e forma uma linha colorida. 3. ESPECIFICAÇÕES DE DESEMPENHO 3.1 Reprodutibilidade A reprodutibilidade do teste foi demonstrada por estudos (intra-ensaio, entreensaio e lote a lote) com painéis de referência desenvolvidos in house. Todos os valores foram idênticos ao critério de aceitação do painel de referência. 3.2 Sensibilidade e especificidade
2 Versão: Pag.: 2 de 5 O limite de detecção: a menor quantidade do marcador alvo que pode ser detectada com precisão foi igual ou superior a um teste rápido comercial líder para detecção de anticorpos de dengue. O teste Alere Dengue IgG/IgM possui uma boa correlação com teste Elisa. Sensibilidade 94,6% e Especificidade 96,5%. 4. AMOSTRA PRIMÁRIA 4.1 Tipos de amostra: soro ou plasma em Heparina, EDTA ou Citrato 4.2 Volume mínimo: 50µL 4.3 Rejeição de amostra: amostras hemolisadas ou lipêmicas devem ser evitadas 4.4 Condições de acondicionamento: refrigerar de 2 a 8 C se o teste for realizado dentro de 2 semanas e se a amostra for analisada num período mais longo, deve-se congelar a <-18 C 5. MATERIAL REQUERIDO Cronômetro 6. REAGENTES KIT: DENGUE IGG E IGM MARCA: ALERE-BIOEASY CONSERVAÇÃO DO KIT: entre 2 a 30 C até a data de validade impressa na parte externa de sua embalagem. Material fornecido pelo kit: Dispositivos de teste para análise contendo: a)conjugado ouro: anti-dengue-ab monoclonal de rato conjugado com ouro; b) Coloide de ouro IgG de rato (para linha Controle), c) Linha Teste G: anticorpo monoclonal IgG anti-humano de rato, d) Linha Teste M: anticorpo monoclonal IgM anti-humano de rato e d) Linha Controle: anticorpo IgG anti-dengue de cabra, área do conjugado, área absorvente e área do antígeno; Diluente de ensaio: tampão Tris, Tween, Cloreto de sódio, Proclin e Azida de sódio Pipeta capilares de 5µL para amostra. 7. PROCEDIMENTOS 7.1 Utilizando Dispositivo de Teste: Antes de iniciar o procedimento a amostra e o dispositivo de teste devem estar a temperatura ambiente (entre 15 e 30 C), homogeneizar as amostras, antes de realizar o teste;
3 Versão: Pag.: 3 de Remover o dispositivo teste da embalagem de alumínio e coloca-lo em uma superfície plana e seca; Pipetar a amostra com auxilio da pipeta capilar que acompanha o kit e adicioná-la à cavidade quadrada do cassete identificada com a letra (S); Adicionar 4 gotas (90-120µL) de diluente do ensaio à cavidade redonda do cassete; Aguardar minutos para ler o resultado e não pode ultrapassar esse tempo; qualquer reação que ocorra após 20 minutos não deve ser considerada; Anotar o resultado no mapa de trabalho que deve ser assinado pelo responsável. 5µL Até marca preta 4gotas 15~20 min 8. CONTROLE DA QUALIDADE 8.1 Um controle processual está incluído no teste. 8.2 Uma linha colorida aparecendo na região da linha do controle (C) é considerada um controle processual interno. Ele confirma o volume de amostra suficiente e as técnicas de procedimento corretas. 8.3 Um fundo claro é um controle processual interno negativo. Se uma cor de fundo aparecer na região do resultado e interferir com a capacidade para ler o resultado do teste, o resultado pode ser inválido. 8.4 Procedimento detalhado no Plano de Qualidade do setor. 9. INTERFERENTES 9.1 Algumas substancias potencialmente interferentes foram adicionadas às amostras negativas e positivas de HCG mas nenhuma delas, nas concentrações testadas, interferiu no ensaio. São elas: Acetaminofeno 20mg/dL, Acido acetilsalicílico
4 Versão: Pag.: 4 de 5 20mg/dL, Acido ascórbico 20mg/dL,Acido gentisico 20mg/dL, Atropina 20mg/dL, Bilirrubina serica 40mg/dL, Cafeina 20mg/dL, Glicose 2g/dL, Hemoglobina 1mg/dL e Triglicerides 1200mg/dL. 10 CÁLCULOS / LIBERAÇÃO DOS RESULTADOS 10.1 Resultado Negativo: Somente a linha Controle (C) pode ser visualizada no dispositivo de teste. Nenhum anticorpo IgG e IgM foram detectados. Repetir o teste em 3-5 dias se houver suspeita de infecção por dengue Resultado Positivo IgM: A linha Controle (C) e a linha Teste (M) podem ser visualizadas no dispositivo de teste, indicando resultado positivo para anticorpos IgM do vírus da Dengue. Este resultado é um indicativo de infecção primária por dengue Resultado Positivo IgG: A linha Controle (C) e a linha Teste (G) podem ser visualizadas no dispositivo de teste, indicando um resultado positivo para anticorpos IgG do vírus da Dengue. Este resultado é um indicativo de infecção por dengue secundária ou passada Resultados Positivos IgG e IgM: A linha Controle (C), a linha Teste (M) e a linha Teste (G) podem ser visualizadas no dispositivo de teste. Este é positivo para ambos os anticorpos IgM e IgG. Este resultado é um indicativo de infecção por dengue primária tardia ou secundária inicial Resultado Inválido: A linha Controle (C) não pode ser visualizada no dispositivo de teste. Volume de amostra insuficiente ou técnicas de procedimento incorretas são possíveis causas do resultado inválido. Repetir o teste utilizando um novo dispositivo de teste.
5 11 INTERVALO DE REFERENCIA DENGUE IGG NÃO REAGENTE: Ausência de anticorpos IgG DENGUE IGM NÃO REAGENTE: Ausência de anticorpos IgM Versão: Pag.: 5 de 5 12 INTERVALO CRÍTICO N/A 13 PRECAUÇÕES DE SEGURANÇA Toda rotina deve ser seguir as normas de Segurança conforme descrito no PG Gestão de Biossegurança. 14 DOCUMENTOS DE REFERÊNCIA 14.1 NBR ISSO 9001: Manual PALC RDC Manual da Qualidade 15 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 15.1 Lam SK, Ver. Med. Micro., 6: Techinical advisory group on dengue haemorrhagic fever/dengue shock syndrome.(1986).dengue fever diagnosis, treatment and control. Geneva, Switzerland: Wordl Health Organization Innis BL, et al Am.J.Trop.Med.Hyg.,40: Makino Y et al Microbiol. Immunol., 38: CDC/NIH. Guidelines (1988). Biosafety im Microbiological and Biomedical laboratories. 2 nd edition Bula fornecida pelo kit : Dengue IgG/IgM ALERE-BIOEASY 16 CONTROLE DE ALTERAÇÕES VERSÃO DATA ITENS MODIFICADOS DESCRIÇÃO DA ALTERAÇÃO Todos Elaboração inicial
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