TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS: REAÇÕES COM ANTICORPOS MARCADOS

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1 TESTES SOROLÓGICOS PRIMÁRIOS: REAÇÕES COM ANTICORPOS MARCADOS

2 INTRODUÇÃO Utilização de anticorpos em Ensaios Sorológicos 1954: Teste de Imunofluorescência (Weller & Coons); 1959: Radioimunoensaio (Yalow & Berson) Anos 60: enzimas conjugadas a antígenos e anticorpos (Nakane & Pierce, 1967; Avrameas, 1969) Anos 70: ELISA (Engvall & Perlmann, 1971); produção de anticopos monoclonais (Kohler & Milstein, 1975) desenvolvimento de novos testes (kits comerciais) Métodos colorimétricos, radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes, etc. Agentes infecciosos, anticorpos, hormônios, alérgenos, poluentes, etc. Ronald & Stimson, 1998

3 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA Anticorpos conjugados com fluorocromos Fluorocromos: substâncias que absorvem luz de menor e, quando excitados com luz ultravioleta, emitem luz de maior (fluorescência) Mais utilizados: isiotiocianato de fluoresceína e rodamina (absorvem em diferentes, mas emitem luz na faixa do visível) Teste direto pesquisa de antígenos (células ou tecidos) Teste indireto pesquisa de anticorpos, ou de antígenos Referência para sorodiagnóstico de várias doenças que acometem os animais, como para a raiva, toxoplasmose, leishmaniose, leptospirose.

4 REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA Luz Incidente (Excitação) Luz Emitida

5 IMUNOFLUORESCÊNCIA

6 Reação de Imunofluorescência Indireta

7 Figure 3.6a Fig 3.6b Principle of Immunofluorescence

8 IMUNOFLUORESCÊNCIA : Vero não-infectada + soro positivo para Coronavírus (Sars) 2: Vero infectada + soro positivo para Coronavírus 3: Esfregaço de sangue com formas de tripanossoma

9 Reação de Imunofluorescência Direta para o Diagnóstico do Vírus da Raiva

10 FIGURE 1 - Photomicrographs of direct immunofluorescence reactions in the presence (A and B) of rabies virus antigens in the brain tissue samples subjected to cryopreservation at -20 C for up to 2 years (immunofluorescence microscope equipped with 400X magnification; Carl Zeiss, Germany). A: Cryopreservation in 68% SUC for 1 year demonstrating very abundant antigens in all fields of view, uncountable (++++). B: Cryopreservation in 68% SUC for 2 years demonstrating few antigens, 1 or more particles in less than 100% but more than 50% of the fields of view (++). SUC: sucrose Source: LABOVIR-UECE, 2012.

11 Reação de Imunofluorescência Indireta para o Diagnóstico do Vírus da Leucemia Felina

12 IMUNOFLUORESCÊNCIA Vantagens: limiar de detecção; específica; reprodutível; simples execução; determinação de classes e subclasses de anticorpos Desvantagens: microscópio de fluorescência; diminuição da fluorescência sob irradiação; subjetividade na leitura; ausência de automação

13 CITOMETRIA DE FLUXO Identificação e separação de células baseadas na dispersão de luz e fluorescência sob feixe de laser Estudo de populações de leucócitos luz dispersa tamanho e forma da célula Identificação de populações e/ou subpopulações de linfócitos T e B FACS (fluorescence-activated cell sorter) separação de uma única célula Barrientos et al., 2000

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20 Anti-CD Linfocitário Citômetro de Fluxo Schematic representation of a flowcytometer. For details please see text. (1) Forward-scatter detector, (2) sidescatter detector, (3) fluorescence detector, (4) filters and mirrors, and (5) charged deflection plates.

21 Anti-CD Linfocitário Citômetro de Fluxo Schematic representation of a flowcytometer. For details please see text. (1) Forward-scatter detector, (2) sidescatter detector, (3) fluorescence detector, (4) filters and mirrors, and (5) charged deflection plates.

22 Mab anti-cd4+ T CD4+ T CD4+ / CD3+ T CD3+ T CD4+ / CD3+ T CD8+ T CD8+ / CD3+ Mab anti-cd3+ T CD4+ Mab anti-cd8+

23 Gating strategy to define lymphocyte subsets. (i) Histogram (univariate) plot of CD3 expression; this onedimensional graph corresponds to a typical bar chart and is called histogram in flow cytometry. (ii) Pseudocolor plot of CD3 versus CD4. This display gives a better view on the distribution of CD3 expression than the histogram, in particular for **CD3 low expressing cells; note both axes are logarithmic, unlike the linear axes of scatter plots in Figure 2. (iii) Cartoon detailing interpretation of quadrant gates of (ii). CD3 + CD4 + cells are displayed in the top right quadrant (46.2% of lymphocytes). CD, cluster of differentiation.

24 Como são detectados / mensurados os níveis de Anticorpos em Fluidos Biológicos?

25 ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato incolor em produto colorido Enzimas mais utilizadas (+ de 25): Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -Galactosidase e Glicose Oxidase Suportes sólidos: microplacas de poliestireno e polivinilcloreto (interação hidrofóbica) Método direto antígenos Método indireto anticorpos Sandwich e Competitivo antígenos e anticorpos Ferreira e Ávila, 1996; Butler, 2000

26 Desnaturação das proteínas adsorvidas (>90%) ELISA Anticopos de captura: 10 a 25% funcionais Ag capturados são 10x mais funcionais do que os adsorvidos na placa Entretanto, 6% necessários para o desenvolvimento do teste

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29 to detect Ab 6. ELISA to detect Ag to detect Ag FIGURE 6-10 Variations in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique, similar to RIA except using an Enzyme (alkaline p, horseradish peroxidase, & β-galactosidase) : safer & less costly.

30 ELISA INDIRETO Antígeno Fonte de proteínas estranhas ao sistema Soro anti Conjugado anti Lavagens

31 ELISA DIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA Soro anti Fonte de proteínas estranhas ao sistema Antígeno Conjugadoanti Lavagens

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34 ELISA INDIRETO COM ANTICORPO DE CAPTURA Soro anti (espécie A) Soro anti (espécie B) (/?) Fonte de proteínas estranhas ao sistema Antígeno (/?) Lavagens Conjugado anti B

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37 ELISA

38 IMMUNOBLOTTING (Western blotting) Transferência de proteínas separadas por eletroforese do gel de poliacrilamida para membranas ELISA Resolução obtida pela separação eletroforética de mistura de proteínas + especificidade de anticorpos usados como sondas para a detecção de Antígenos Suportes: membranas de nitrocelulose (interações hidrofóbicas); nylon, polyvinyldifluoride (PVDF) alta capacidade de ligação a proteínas Quantificação de bandas por densitometria Stott, 2000

39 IMMUNOBLOTTING (Western blotting)

40 IMMUNOBLOTTING (Western blotting)

41 IMMUNOBLOTTING (Western blotting)

42 IMMUNOBLOTTING (Western blotting)

43 IMMUNO-DOT DOT-ELISA reação imunoenzimática sobre membranas Qualitativa ou semi-quantitativa: rápida e simples Proteínas solúveis, fungos, protozoários, bactérias e vírus Stott, 2000

44 IMMUNO-DOT

45 IMUNOHISTOQUÍMICA / IMUNOCITOQUÍMICA Detecção e localização de antígenos celulares/teciduais Anticorpos conjugados com enzimas conversão de substrato incolor em produto colorido (deposição pode ser observada diretamente ao microscópio óptico) Enzimas mais utilizadas: Peroxidase; Fosfatase Alcalina, -Galactosidase e Glicose Oxidase Método direto Acs primários conjugados (detecção de antígenos) Método indireto Acs secundários conjugados (detecção de antígenos ou anticorpos) Desvantagens: atividade enzimática endógena, armazenamento inadequado dos conjugados Ferreira & Ávila, 1996; Kumar, 2000

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47 IMUNOHISTOQUÍMICA H 2 O 2 + DAB Peroxidase H 2 O + 1/2 O 2 + DAB (Oxidada = COR) Detecção de bacilos nas vilosidades intestinais

48 IMUNOHISTOQUÍMICA Peroxidase H 2 O 2 + DAB H 2 O + 1/2 O 2 + DAB (Oxidada = COR)

49 Método ABC IMUNOHISTOQUÍMICA Ags em Células / Tecidos Ags em Células / Tecidos Ags em Células / Tecidos Ags em Células / Tecidos Peroxidase H 2 O 2 + DAB H 2 O + 1/2 O 2 + DAB (Oxidada = COR)

50 IMUNOHISTOQUÍMICA Substrato Produto Peroxidase 3,3 -Diaminodenzidine tetrahydrochloride (DAB) 4-Chloro-1-naphthol (CN) P-Phenylenediamine dihydrochloride Marrom Azul Azul-preto Fosfatase alcalina 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate (BCIP), nitroblue tetrazolium (NBT) Azul-preto -Galactosidase 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl- -D-galactosidase (IbGa) Glicose Oxidase Glicose/trinitroblue tetrazolium (TNBT) Azul Marrom Kumar, 2000

51 IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

52 IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

53 IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA NASA

54 IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

55 IMUNOMIGRAÇÃO RÁPIDA

56 RADIOIMUNOENSAIO Limiar de detecção: nano ou picogramas Quantificação de hormônios, drogas, marcadores tumorais, alérgenos, anticorpos e antígenos microbianos Quantidade de reagente marcado (Ag ou Ac) quantifica o Ag ou Ac não-marcado na amostra competição Marcação com radioisótipos ( 125 I e 131 I) Determinação de curvas-padrão Desvantagens: custo, vida média dos reagentes e risco operacional Ferreira & Ávila, 1996

57 RADIOIMUNOENSAIO Lembrando o equilíbrio! Ac + Ag* AcAg* AcAg* + Ag AcAg* + AcAg + Ag*

58 Curva-padrão RADIOIMUNOENSAIO

59 LIMIAR DE DETECÇÃO Rose et al, 1997

60 REFERÊNCIAS Diagnóstico Laboratorial das Principais Doenças Infecciosas e Auto-Imunes. A. W. Ferreira; S. L. M. Ávila. Editora Guanabara Koogan, 1996.