HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO NO BRASIL

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1 HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO NO BRASIL 1ª reunião em 10/12/ Laboratório Fleury INÍCIO 2ª reunião em 18/03/ Laboratório Sergio Franco 3ª reunião em 05/08/ Fundação Maria Cecília Souto Vidigal 4ª reunião em 09/02/ Hemocentro de Botucatu HC Faculdade de Medicina UNESP 5ª reunião em 30 e 31/08/ Hospital Israelita Albert Einstein 6ª reunião em 19/06/ Hotel Casa Grande no Guarujá, I Congresso Ibero-Latino Americano de Citometria de Fluxo 7ª reunião em 24/03/2002 II Simpósio Internacional de Citometria de Fluxo- Hospital Israelita Albert Einstein 8ª reunião em 16 a 18/04/2009 III Simpósio Internacional de Citometria de Fluxo- Hospital Israelita Albert Einstein

2 HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO NO BRASIL HEMO ª reunião do GBCFLUX : 24/abril/ DASA 2ª reunião do GBCFLUX : 19/junho/ Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - SP 3ª reunião do GBCFLUX : Laboratório Fleury

3 HC-UFPR CITOMETRIA DE FLUXO HISTÓRICO E PRINCÍPIOS CITOMETRIA DE FLUXO PARA CLÍNICOS PROGRAMA EDUCACIONAL HEMO 2010 Mariester Malvezzi Universidade Federal do Paraná

4 HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO Inicia com a Microscopia no século XVII - Loewenhoek Século XIX Corantes Erlich 1880-Fluoresceína 1934 Moldavan sugere um aparelho que conte células com um fotodetector que registra a passagem da célula. Anos Microscopia de fluorescência em lâmina # - corantes para ácidos nucleicos de células neoplásicas # - ligação de anticorpos a marcadores de fluorescência 1956 Coulter desenvolve um sistema que conta as células sanguíneas através de sinais elétricos, enquanto elas passam por um fluxo contínuo.

5 HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO 1965 Fulwyler Lab Nac de Los Alamos desenvolve um aparelho que separa eritrócitos, combinando a tecnologia Coulter com a tecnologia do jato de tinta usada em impressoras - vibração Kamenstsky e Melamed colocam a célula em um tubo capilar e a separam em fluxo Wolfgang Gohde Un. Munster+Partec Impulszytophotometrie 1969 Van Dilla utiliza em um mesmo aparelho a fluorescência + princípio de focalização hemodinâmica + iluminação a laser.

6 HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO 1972 Herzenberg usou Anticorpos ligados à fluoresceína, BD e cunhou o termo FACS Fluorescence Activated Cell Sorter 1975 Kohler e Milstein criam os primeiros anticorpos monoclonais, através da fusão de material genético de células B antígenoespecíficas com células de mieloma múltiplo. Após houve uma colaboração frenética entre cientistas e indústria citômetros para pesquisa facilidade no uso citômetros mais acessíveis para o laboratório clínico a partir de Conferência de Engenharia da Fundação Americana muda o nome de Impulszytophotometrie para Citometria de Fluxo

7 CITÔMETROS

8 CITÔMETROS EPICS 1977/78 FACSCan

9 HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO SHAPIRO, M.H. Practical Flow Cytometry, 3ed, New York, Wiley-Liss, Dr. Álvaro Luiz Bertho, PhD

10 ÁREAS DO CONHECIMENTO LIGADAS À CITOMETRIA DE FLUXO SISTEMA DE FLUXO COULTER LASER SEPARAÇÃO CELULAR ANTICORPO MONOCLONAL FLUOROCROMO CITOQUÍMICA PROGRAMAS ANÁLISE COMPUTAÇÃO

11 IMUNOFENOTIPAGEM COMPARAÇÃO ENTRE IMUNOFLUORESCÊNCIA POR MICROSCOPIA E CITOMETRIA DE FLUXO MICROSCOPIA CITOMETRIA * CÉLS/ EXAME * > 1 MILHÃO CÉLS/ EXAME * 5 MINUTOS / TESTE * 1 MINUTO / TESTE * SUBJETIVO * OBJETIVO * POSITIVO/NEGATIVO * MULTIPARAMÉTRICO * BAIXA REPRODUTIBILIDADE * ALTA REPRODUTIBILIDADE * TRABALHOSO * AUTOMATIZADO

12 O QUE É? Método de análise citológica através de instrumento equipado com laser, que permite a identificação, a caracterização, a contagem e a separação física de células em suspensão.

13 PROPRIEDADES Permite avaliar um grande número de células Em curto período de tempo Com grande sensibilidade e especificidade Proporcionando informação multiparamétrica

14 FLUXO 1- Preparo da amostra em bancada - Paineis 2- Passagem da amostra no citômetro 3- Análise dos gráficos

15 FLUXO 1- Preparo da amostra em bancada -Paineis 2- Passagem da amostra no citômetro 3- Análise dos gráficos

16 É PRECISO SABER O QUE É CD? NÃO É COMPACT DISK. É CLUSTER OF DIFFERENTIATION. PADRONIZA AS VÁRIAS ORIGENS DE CLONES DE ANTICORPOS MONOCLONAIS UTILIZADOS PELAS DIVERSAS EMPRESAS, AGRUPANDO-OS NUM SÓ NÚMERO, SEGUIDO OU NÃO DE LETRAS MINÚSCULAS. O MESMO NOME DO CD DEFINE O ANTÍGENO. Cada CD é ligado a um fluorocromo específico-id Paineis Morfologia?

17 FLUXO 1- Preparo da amostra em bancada - Paineis 2- Passagem da amostra no citômetro 3- Análise dos gráficos

18 FUNDAMENTOS ANALISA PARTÍCULAS em SUSPENSÃO. PARTÍCULAS + AcMo LIGADO ao FLUOROCROMO. ALINHAMENTO das CÉLULAS umas ATRÁS das OUTRAS em uma CORRENTE FLUÍDICA. PASSAGEM por uma FONTE LUMINOSA - LASER. GERAÇÃO de DISPERSÃO de LUZ ao ENCONTRAR a CÉLULA. EMISSÃO de NOVAS CORES PRODUZIDAS pelos DIFERENTES FLUOROCROMOS, LIGADOS aos AcMo ESPECÍFICOS. DETECÇÃO dos SINAIS LUMINOSOS. TRANSFORMAÇÃO em IMPULSOS ELETRÔNICOS. AMPLIFICAÇÃO dos SINAIS ELETRÔNICOS. CONVERSÃO DESTES em SINAIS DIGITAIS. ANÁLISE em PROGRAMA de COMPUTADOR.

19 É PRECISO SABER *Parâmetros de dispersão de luz FSC tamanho celular - viabilidade e conteúdo de DNA SSC composição interna - grânulos, organelas e núcleo *Parâmetros de fluorescência # FL1 FITC = Fluoresceína # FL2 PE = Ficoeritrina # FL3 PECy5=Cianina, PerCP=Peridinina, ECD # FL4 APC = Alocianina

20 Dispersão de Luz Laser Sensor FSC 5º Sensor SSC 90 0

21 Dispersão de Fluorescência Fluorescência

22 Dispersão de Luz + Fluorescência Laser.FSC. Detectores de Fluorescência (PMT1, PMT2, etc.). SSC

23 INTERIOR DE UM CITÔMETRO DE 04 CORES C É L U L A S P A S S A N D O

24 FLUXO 1- Preparo da amostra em bancada - Paineis 2- Passagem da amostra no citômetro 3- Análise dos gráficos- Programas de Análise

25 Tipos de diagramas 1 parâmetro Histograma 2 parâmetros Dot Plot

26 CÉLULAS CD34+

27 SSC CD45 EM MO NORMAL CD45 EM MO NORMAL A UNGATED BM EVENTS Eosinophils HPC Basophils pdc CD34 + B-cell precursors Monocytic cells NRBC Mature Lymphocytes CD45-PerCP CD34 - B-cell precursors Orfao,A. 2009

28 EVOLUÇÃO

29 CITÔMETROS FACSCalibur FC-500 FACSCanto II

30 CITÔMETROS FACS-ARIA EPICS-ALTRA

31 NOVOS LASER/FLUOROCROMOS 1-Laser azul 488nm: FITC 519nm, Alexa Fluor nm, PE- 578nm, PE-Texas Red- 615nm, PE-Cy5-667nm, PerCP- 678nm, PerCP-Cy nm, PE-Cy7-785nm. 2- Laser vermelho 640nm: APC- 660nm, Alexa Fluor nm, Alexa Fluor nm, APC-Cy7-785nm, APC-H7-785nm. 3- Laser violeta 405nm: Horizon V nm, Pacific Blue- 452nm, Am Cyan- 491nm, Horizon V nm. 4- Laser verde 532/561nm: PE- 578nm, PE-Texas Red- 615nm, PE-Cy5-667nm, PE-Cy7-785nm.

32 O que mais podemos analisar por Citometria de Fluxo? Tamanho Complexidade Antígenos celulares Metabolismo Receptores DNA Citocinas Enzimas

33 FUTURO

34 FUTURO? TUDO É POSSÍVEL

35 HOSPITAL DE CLÍNICAS DA - UFPR UFPR OBRIGADA EQUIPE DE IMUNOFENOTIPAGEM Ana Paula de Azambuja Edna Martins Eliana L Lima Elisa Novello Juli Pimentel Maria Tadeu L Rocha Miriam P Beltrame Noeli T Silva

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39 CITÔMETROS Wolfgang Gohde-Citometria de fluxo baseada em fluorescência- IMPULSZYTOPHOTOMETRIE-Un de Munster+Partec 1971-Cytofluorograph-Ortho diagnostics 1973-PAS 8000-Partec 1974-FACS-BD 1975-ICP22-Partec EPICS- Coulter

40 Dispersão de Luz Laser FSC SSC

41 CD8 CD7 LINFÓCITOS T MADUROS CD4 CD2

42 CITÔMETROS CyAn Partec

43 Tamanho - FSC X Complexidade - SSC FSC X SSC FSC X SSC FSC X SSC PLAQUETAS NORMAIS PLAQUETAS DIÂMETRO AUMENTADO PLAQUETAS GIGANTES

44 Gráfico de Fluorescência R2

45 O que é necessário para a imunofenotipagem celular? Citômetro de fluxo: compensação, calibração e controles negativos Anticorpos monoclonais Fluorocromos Paineis Programas de Análise

46 CITÔMETROS

47 HISTÓRICO DA CITOMETRIA DE FLUXO NO BRASIL Curitiba-antes de 1985-Ac trazidos da Itália pelo Dr.Eurípedes permitiam fazer diagnóstico de leucemias com E-roseta, Zimosan e a citotoxicidade. Em 1985 Dr. Raul Ribeiro trouxe dos EUA Ac e a reação em placa, que colocada em lâminas eram lidas em microscópio de imunofluorescência. FMUSP-1993-Beatriz Beutler Em 1993-citometria de fluxo 1997 FACSVantage EPM imunofenotipagem por imunofluorescência APPAP-imunocitoquímica 1997-Citômetro FACSCalibur Maria do Socorro Pombo de Oliveira-INCA, Valéria Buccheri-Fundação maria Cecília Vidigal, Neusa Melo -USP=Dr. Catovski Lab Fleury-Dra.Maria Hsu 1994=1ª reunião de Citometria de Fluxo, HAEinstein-Dra. Nydia Bacal

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