DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA EM LEUCEMIAS AGUDAS
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- Denílson Nobre Soares
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1 DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA EM LEUCEMIAS AGUDAS Estratégias Atuais e Importância no Contexto do TMO JAÚ 02/07/2011 Mariester Malvezzi Hospital de Clínicas Universidade Federal do Paraná
2 DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA PREMISSA Melhorar a estimativa da massa leucêmica de um paciente,
3 DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA PREMISSA Melhorar a estimativa da massa leucêmica de um paciente, com o intuito de melhorar o manejo clínico e os índices de cura.
4 CONSIDERAÇÕES O Antigo: Remissão morfológica < 5% de blastos em MO - identificação de células imaturas em MO em regeneração - 10¹º de células leucêmicas O Novo: Remissão imunológica/molecular - por Citometria de fluxo - por PCR
5 DRM em LLA Remissão clínica Recidiva Número de células neoplásicas Limite de detecção da morfologia D R M Cura Indução Consolidação Manutenção
6 DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA QUESTÕES CRUCIAIS 1) Quais os melhores momentos de realização da pesquisa de DRM? 2) Qual dos métodos aplicar? 3) Quais os níveis aceitáveis de remissão completa ou de DRM? 4) Qual o tempo entre a recaída imunológica / molecular e a morfológica? 5) É possível melhorar a sobrevida através da mudança de tratamento?
7 DOENÇA RESIDUAL MÍNIMA Tempo Objetivo Durante a I. remissão Mensurar a resposta precoce ao tratamento Final da I. remissão Identificar paciente de risco de recaída Durante o tratamento Detectar recaída iminente Detectar sítio extramedular Antes de TCTH Determinação do tratamento Detecção recidiva precoce
8 MÉTODOS de QUANTIFICAÇÃO de DRM em LLA 1. Imunofenotipagem por citometria de fluxo multiparamétrica 2. RQ-PCR baseada na detecção de transcritos de genes de fusão ou quebras cromossômicas 3. RQ-PCR: baseada na detecção de Ig clonal e rearranjo do gene do receptor de célula T PADRONIZAÇÃO Szczepánski, Leukemia 21:622, 2007 Brüggemann et al, Leukemia 24:521, 2010
9 RQ-PCR para Transcritos em LLA Sensibilidade: 10-4 a 10-6 Aplicabilidade: LLA-B: 40-45% LLA-T: 15-35% Vantagens: +/- fácil e barato, sensível, leucemiaespecífico. Genes de fusão: t(9;22) BCR-ABL t(4;11) MLL-AF4 t(12;21) TEL-AML1 t(1;19) E2A-PBX1 Desvantagens: utilidade em 50%, 20% falsopositivos, variabilidade dos níveis dos transcritos Szczepánski, Leukemia 21:622, 2007 Brüggemann et al, Leukemia 24:521, 2010
10 RQ-PCR para Ig e TCR em LLA Sensibilidade: 10-4 a 10-5 Aplicabilidade: LLA-B: 90-95% LLA-T: 90-95% Vantagens: sensível, paciente-específico, padronizado, estabilidade do DNA Desvantagens: Demorado, caro, necessita duas sondas por paciente, rearranjos durante curso da doença, falso-negativos, expertise. Szczepánski, Leukemia 21:622, 2007 Brüggemann et al, Leukemia 24:521, 2010
11 Citometria de Fluxo em LLA Sensibilidade: 10-3 a 10-4 em 3-4 cores 10-4 a 10-5 em 6-9 cores Aplicabilidade: LLA-B: 80-95% LLA-T: % Vantagens: rápido, relativamente barato, aplicabilidade, > sensibilidade, dados adicionais das células normais e anormais, padronização europeia Desvantagens: <sensibilidade <cores, modulação do fenótipo, probabilidade de mudança fenotípica, <celularidade na IR, expertise >cores Szczepánski, Leukemia 21:622, 2007 Brüggemann et al, Leukemia 24:521, 2010
12 CITOMETRIA DE FLUXO Multiparamétrica Identificar o fenótipo associado à leucemia Quantificar as células anormais Diferenciar o fenótipo leucêmico do fenótipo da célula normal
13 MEDULA ÓSSEA NORMAL Eosinófilos Linhagem neutrofílica Linhagem monocítica T-SSC CD34+ CTH Linhagem eritroide CD45 PERCPCY5,5 -> CD45-PerCP Linfócitos Dr. Orfao
14 MEDULA ÓSSEA NORMAL Plasmócitos Populações raras
15 DISTRIBUIÇÃO DAS POPULAÇÕES DE MO NORMAL Subgrupos MO Normal (n=12) % CD ( ) % CD34+ or CD (0.6-6) % Erythroid cells (2-9) % Neutrophils (57-80) % Monocytic cells (2-6.5) % Eosinophils (0.8-5) % Basophils (< ) % Mast cells (<0.03) % Plasma cells ( ) % Mature B-cells ( ) % B-cell precursors ( ) % T-lymphocytes (2.6-18) % NK-cells (0.7-5) Orfao et al
16 CÉLULAS CD34+ EM MO > FSC-Height MON PECy5 -> CD45 PC5 MON APC -> CD34 APC MON Precursor Mieloide Precursor Linfoide
17 IMUNOFENÓTIPO DE CTH CD34+ COMISSIONADA A LIN MIELOIDE LINHAGEM SSC IMUNOFENÓTIPO Eritroide interm CD36+, CD64-, CD45lo Megacariocítica alto CD61+, CD45lo Neutrófilo alto cmpo+, CD13hi Eosinófilo alto cmpo-, CD15/65+, EPO+ Basófilo baixo CD123hi, HLADRlo, CD117lo CD45hi Monocítica interm MPO-, HLADR+, CD117+/lo Mastócito baixo CD117hi, HLADRlo, CD45hi CDPlasm interm CD123hi, HLADRhi, CD4+
18 Valores de referência de Células CD34+ em MO Ogata et al, Blood 2006
19 MATURAÇÃO
20 Diferenciação Normal dos Linfócitos B Grandes Pequenos Imaturo Maduro Pro-B Pre-B I Pre-B II Pre-B II Pre-B II CD34+ CD22+ CD10- CD19- CD20- CD34+ CD22+ CD10+ CD19- CD20- CD79a+ TdT+ CD34+ CD22+ CD10+ CD19+ CD20- CD79a+ TdT+ cyigµ- CD34- CD22+ CD10+ CD19+ CD20+ CD79a+ TdTcyIgµ+ Pre-BCR+ CD34- CD22+ CD10+ CD19+ CD20+ CD79a+ TdTcyIgµ+ Pre-BCR- CD34- CD22+ CD10+ CD19+ CD20+ CD79a+ TdTcyIgµ+ sigm- CD34- CD22+ CD10+ CD19+ CD20+ CD79a+ TdTsIgM+ sigd- CD34- CD22+ CD10- CD19+ CD20+ CD79a+ TdTsIgM+ sigd+ IGH DJ VDJ IGK rearranjo deletado(em Igλ+ celulas) IGλ rearranjo (em Igλ+ celulas) Ghia et al, 1996; Lucio et al, 1999; LeBien et al, 2000
21 MATURAÇÃO DA LINHAGEM LINFOIDE B EM MO NORMAL CD38 ccd79a CD34 CD10 TdT CD45 CD22 CD19 CD20 Dr. Orfao
22 CD45 - MO eosinófilos Basófilos,CD plasmocitoides e mieloides neutrófilos monócitos CPr mieloide CD monocitoide eritroblastos linfoide B Precursora CD34+ linfoide B Precursora CD34- LB/LT/LNK
23 DRM - CITOMETRIA DE FLUXO SUBPOPULAÇÕES NORMAIS LB em MO em ADULTOS POP. 1: CD19dim/34+/TdT+/10fo/22dim/45dim/38fo/20(-) N: 0,44 ± 0,65% POP. 2: CD19+/34(-)/TdT(-)/10+/22dim/45+/38fo/20dim N: 3,75 ± 5,75% POP. 3: CD19+/34(-)/TdT(-)/10(-)/22fo/45fo/38dim/20fo N: 2,58 ± 1,43% Lucio P. et al., Leukemia, 13: , 1999
24 Diferenciação Neutrofílica MO normal I II III IV V Mieloblasto Promielócito Mielócito Meta- Neutrófilo MPO MPO MPO mielócito/ Bastão MPO CD34 CD117 CD117 MPO HLA-DR CD13+forte CD13+forte CD13+fraco CD13+ CD13+forte CD33+forte CD33+forte CD33+fraco CD33+fraco CD33+fraco CD15 CD15 CD15 CD15 CD11b CD11b CD11b+forte CD16 CD16+forte CD34/CD117/CD45/CD13.33 Dra. Silvia Pires Ferreira CD16/CD13/CD45/CD11b
25 DIFERENCIAÇÃO DA LINHAGEM NEUTROFÍLICA EM MEDULA ÓSSEA NORMAL MIELOBLAST0 PROMIELÓCITO MIELÓCITO METAMIELÓCIT O NEUTRÓFILO CD15 CD13 CD64 MPO CD CD33 CD65 CD CD11b 10 1 CD16 CD10 CD34 HLA-DR CD117 CD54 Dr.Orfao
26 MUDANÇAS FENOTÍPICAS DE LINHAGEM MONOCÍTICA EM MEDULA ÓSSEA NORMAL 10 4 MONOBLAST PROMONOCYTE MONOCYTE CD64 Lisozyme CD HLA-DR CD11b CD CD34 CD36 CD14 CD4 IREM-2 MPO 10 1 Dr.Orfao
27 DRM EM LLA-B BIOMED Lucio et al, Leukemia 15: , 2001
28 DRM EM LLA-B BIOMED Lucio et al, Leukemia 15: , 2001
29 CD7+: SUBGRUPOS NORMAIS EM MO BIOMED-Porwit et al, Leukemia 14: , 2000
30 SUBGRUPOS NORMAIS E LLA-T BIOMED-Porwit et al, Leukemia 14: , 2000
31 SUBGRUPOS NORMAIS E LLA-T BIOMED-Porwit et al, Leukemia 14: , 2000
32 DRM LLA-T LLA-B Orfao et al
33 BLASTO: 78,9% LTN: 11,1% LLA-T DRM CD34 CD7 CD3 BLASTO: 0,04% LTN: 9,37% CD34 CD7 CD3 CD5
34 Maturação normal das linhagens mieloide e monocítica em medula óssea Mono B Lym Blast Mono A Myel Blast HLA-DR FITC RBC C SSC Myel Promielócito Blast Loken et al, Leuk Res, HLA-DR FITC
35 CD45 CD45 CD45 LMA DRM CD13 CD34 CD34 CD34
36 CITOMETRIA DE FLUXO Expressões Antigênicas Aberrantes Expressão de antígenos de outra linhagem LLA CD13, CD15, CD33 LMA CD2, CD4, CD5, CD7, CD19, CD22, CD56 Assincronismo de expressão dos antígenos CD11b, CD15 ou CD16 em células CD34+ Ausência de expressão de antígenos. CD33neg em LMA, CD5neg em LLA-T Superexpressão de antígenos CD34, CD56, CD14 na LMA; CD10 na LLA-B; CD7 na LLA-T Parâmetros de dispersão anormais FSC e SSC altos ou baixos
37 LLA: FENÓTIPOS ABERRANTES LLA-B (98%) LLA-T (100%) Assincronismo de Ag CD34+ CD10+d 54% CD5d/CD2d 60% TdT+d CD % Superexpressão de Ag CD10 32% CD7 55% Expressão Ag My CD13 32% CD13 16% CD33 17% CD33 10% Fenótipos anormais Vidriales et al, Haematologica, 2003 CD7+/TdT+ CyCD3+ 91% CD34+CD7+ 40%
38 LMA: FENÓTIPOS ABERRANTES ASSINCRONISMO DE EXPRESSÃO ANTIGÊNICA EM 80% CD34 + HLA-DR - CD33 + 9% CD117 + CD11b + 5.5% CD34 + CD56 + 8% CD117 + CD33 - CD34 - CD15 + 4% CD34 + CD11b + 5% CD117 + HLA-DR - CD % CD34 + CD % CD117 - HLA-DR - CD15-2.3% CD34 + CD14 + 3% CD117 - HLA-DR + CD33 + CD34-0.8% CD34 + CD117 + HLA-DR - 2.3% CD33 ++ HLA-DR - CD34 - CD15 - CD14-17% CD34 + CD117 - CD % CD33 - CD13-14% CD34 + CD33 - CD13 + HLA-DR + 1.5% CD33 + CD13-7% CD34 + CD33 - CD13 + HLA-DR - 0.8% CD33 + HLA-DR -+ CD4 + CD45 dim 0.8% CD34 + CD33 - CD117 + HLA-DR + 0.8% CD33 ++ HLA-DR -+ CD15 - CD14-0.8% CD117 + CD33 + HLA-DR 11% CD33 + CD45 dim CD34 - CD15-0.8% CD117 + CD34 - CD15-6% CD33 + HLA-DR + CD56 - CD13 - San Miguel et al, Blood, %
39 SUBGRUPOS EM LMA DIAGNÓSTICO RECAÍDA
40 CITOMETRIA DE FLUXO Nível de Detecção de DRM ou 0,01% em LLA ou 0,1% em LMA - Número de anormalidades em 04 cores: - LLA-T > 1 anormalidade - LLA-B > 1 anormalidade em 86% 4-5 anormalidades em 29,7% - Melhor detectável em LLA que LMA heterogeneidade LLA-B : 90-95% LLA-T: % LMA: 80-85% - Correspondência de detecção em SP e MO em LLA LLA-T: 100% LLA-B: 37% - alto risco de recaída
41 LLA
42 DRM - CITOMETRIA DE FLUXO Leucemia linfoblástica aguda 10-15% das crianças com LLA-B fazem recaída Risco cumulativo de recidiva em 3 anos: 5% - baixo risco < % - intermediário > 10-4 e < % - alto risco > 10-2 Incidência cumulativa de recidiva: Semana % de DRM 5 anos incidência de recidiva DRM + DRM 06 25,5 43 ± 11% 10 ± 3% 14 13,8 69 ± 16% 10 ± 3% 32 3,8 86 ± 17% 14 ± 4% 56 4,3 51 ± 25% 12 ± 4% Coustan-Smith et al, Blood, 96: , 2000 Coustan-Smith et al, Lancet, 351: , 1998
43 Combinações Imunofenotípicas usadas no estudo de DRM na LLA Linhagem Diferenças Fenótipo % Freqüência (10-3 a 10-4 ) LLA-B Quantitativa CD19/CD34/CD10/TdT CD19/CD34/CD10/CD CD19/CD34/CD10/CD CD19/CD34/CD10/CD Qualitativa CD19/CD34/CD10/CD CD19/CD34/CD10/CD CD19/CD34/CD10/CD CD19/CD34/CD10/CD CD19/CD34/CD10/CD CD19/CD34/CD10/CD CD19/CD34/CD10/KORSA CD19/CD34/TdT/cytoplasmic µ CD19/7.1 e CD19/p LLA-T Qualitativa TdT/CD CD34/CD Campana & Coustan-Smith, Cytometry, 1999
44 MOMENTOS da DRM por CFLUXO em LLA D19 da Indução de Remissão: Coustan-Smith et al. Blood 100: 52-58, Risco Cumulativo de Recaída RCR em 5 anos em 46% (51p) com DRM<0,01% foi 6,0% D15 da Indução de Remissão: 815 pacientes fator prognóstico independente. Basso et al. JCO 27: , Risco Cumulativo de Recaída RCR em 5 anos em 23% (187p) com DRM<0,01% foi 6,4% D7 da Indução de Remissão: <25% de blastos em MO = resposta precoce à indução. Nachman et al. JCO 27: , Adolescentes e adultos jovens: Intensificação pós IR com ASP+VCR+MTX em pacientes de alto risco e baixa resposta à IR - 77,5% para 83,2% SG em 5 anos
45 Leucemia Linfoblástica Aguda B Ph+ Incidência: 1 a 3 % em criança 25% em adulto Antes: <1/3 curavam Hoje: 2/3 curam c/ TCTH alogênico (20%) Schultz (COG): 92% das crianças- QT+Imatinibe= aumentou de 35% para 80% SLE em 3 anos DRM no final da IR: 88,2%com DRM<0,01% -Pode abolir a força prognóstica da DRM Pui,CH JC0 27: , 2009
46 DRM-LLA- CITOMETRIA DE FLUXO RECOMENDAÇÕES TÉCNICAS Amostra Aquisição Fluorocromos DRM positiva DRM negativa EUROFLOW Sangue total ou mononuclear ~1x cores Mínimo de 100 células anormais < 20 células anormais / 1x10 4 I-BFM-LLA- FLOW-MRD Sangue total ou mononuclear ~1x10 6 >= 4 cores Mínimo de 30 ev. anormais/ tubo < 10 células anormais /tubo Brüggemann et al, Leukemia 24:521, 2010
47 LMA
48 DRM - CITOMETRIA DE FLUXO Leucemia mieloblástica aguda Avaliação no término da indução de remissão 70-80% têm fenótipos aberrantes Investigar diferenciação de progenitores mielóides O nível de DRM é 10-4 em células nucleadas totais Risco cumulativo de recidiva em 3 anos: Risco Recidiva Nível DRM RCR Muito baixo < 10-4 zero Baixo 10-4 a % Intermediário < 10-3 a % Alto > % San Miguel, JF et al., Blood, 98: , 2001
49 Combinações Imunofenotípicas usadas no estudo de DRM na LMA Painel % Frequência 10-3 a 10-4 CD13/CD33/CD34/CD11b CD13/CD33/CD34/CD CD13/CD33/CD34/CD CD13/CD33/CD34/CD CD13/CD33/CD34/CD CD33/CD34/CD117/CD CD33/CD34/CD117/CD CD33/CD34/CD117/HLA-DR CD33/CD34/CD117/CD11b CD13/CD33/CD34/CD CD13/CD33/CD34/CD CD13/CD33/CD34/CD Campana & Coustan-Smith, Cytometry, 1999
50 DRM - CITOMETRIA DE FLUXO Leucemia mieloblástica aguda 46 pacientes 85,2% DRM 0,1-0,01% - 26,5% >= 0,1% DRM pós final de I. remissão e sobrevida estimada em 2 anos: - 33,1± 19,1% para DRM >=0,1% - 72,1 ± 11,5% para DRM < 0,1% Coustan-Smith et al, Br. J. Haematol. 123: , 2003
51 TCTH
52 DRM - CITOMETRIA DE FLUXO Leucemia mieloblástica aguda DRM X TAuCT - 31 pacientes: 23 SP E 8 MO - TAuCT < pós 6m da RC - DRM pós indução, consolidação, pré TR, pós a cada 3m por 2anos - Baixo risco: < 3,5 x 10-4 e Alto risco > 3,5 x Recaída: 26% 100% - Estratégico: DRM pré-tauct - Ausência de DRM não impede recidiva. Venditti, A. et al., Leukemia, 17: , 2003
53 Impact of Pretransplantation Minimal Residual Disease, As Detected by Multiparametric Flow Cytometry, on Outcome of Myeloablative Hematopoietic Cell Transplantation for Acute Myeloid Leukemia Walter et al. J Clin Oncol, 29:1190, 2011
54 DRM - CITOMETRIA DE FLUXO Leucemia mieloblástica aguda 99 pacientes com LMA em 1ª remissão morfológica de 2006 a 2009 Fatores analisados: DRM, RC ou RCi em sangue periférico, citogenética, LMA secundária, índice de comorbidade e escore de mortalidade pós-tch Walter et al. J Clin Oncol, 29:1190, 2011
55 DRM - CITOMETRIA DE FLUXO Combinações Imunofenotípicas usadas na LMA PB FITC PE TRed PECy5 PECy7 Alexa594 APC APCA700 APC-H7 1- Dr Dr Walter et al. J Clin Oncol, 29:1190, 2011
56 DRM - CITOMETRIA DE FLUXO Leucemia mieloblástica aguda DRM: toda população diferente do normal ou de MO em regeneração Aquisição: até 1 milhão de eventos Quantificação: do total de células CD45+ DRM em 24 pacientes: Qualquer nível * < 0,01% : 2 pacientes * 0,01 0,1% : 8 pacientes * > 0,1% : 14 pacientes Walter et al. J Clin Oncol, 29:1190, 2011
57 DRM LMA- CITOMETRIA DE FLUXO CONCLUSÕES 1) DRM negativa Em 2 anos: SLD e SG 75% Recaída < 20%. 2) DRM positiva Em 2 anos: recaída de 60% 3) Fator de risco adverso, mesmo após ajuste dos outros fatores de mau prognóstico. Walter et al. J Clin Oncol, 29:1190, 2011
58 Pre-transplant Minimal Residual Disease in Recipients of Allogeneic Transplantation for AML 74 pacientes, único centro, retrospetivo Alotransplante para LMA de DRM por CFluxo: 04 cores, S: 0,04% Características: Idade: 20.8 a 70,1 anos Condicionamento:Mieloablativo e Intensidade reduzida, Depleção de LT Doador: Relacionado 35% Não relacionado 65% Doença: RC1, RC2, RC>2, NR Dignan et al, The Royal Marsden,2008
59 Pre-transplant Minimal Residual Disease in Recipients of Allogeneic Transplantation for AML DRM negativa: 70% DRM positiva: 29% p=0.003 Dignan et al, The Royal Marsden,2008
60 Relationship between minimal residual disease measured by multiparametric flow cytometry prior to allogeneic hematopoietic stem cell transplantation and outcome in children with acute lymphoblastic leukemia Elorza et al, Haematologica 95:936,2010
61 TCTH EM LLA 31 crianças de 10m a 16 anos com LLA-B et Em 1ª remissão ou não Doador relacionado ou não Ifeno 10 dias antes SLD (21) DRM< 0,01% 74% 80% SG (2anos) (10) DRM >= 0,01% 20% 20% Elorza et al, Haematologica 95:936,2010
62 New markers for minimal residual disease detection in acute lymphoblastic leukemia Comparação da expressão genômica do Linfoblasto de 270 crianças com LLA com precursores normais de LB CD19+CD10+, por microarray. Análise de genes 30 novos marcadores. Genes anormais encontrados no Linfoblasto foram testados por CFluxo e validados para pesquisa de DRM em pacientes com LLA- B. DRM+ 0,01% 07 cores RESULTADOS: 1-12,7% tinham expressão anormal e negativaram na recaída 2-17,2% tinham expressão normal e positivaram na recaída 3-100% permaneciam com pelo menos 01 marcador anormal Novos marcadores: CD24, CD44, CD72, CD73, CD79b, CD86, CD123, CD200, HPSB1, Bcl2. Coustan-Smith et al., Blood 117: 6267, 2011
63 DRM - CITOMETRIA DE FLUXO Leucemias agudas Falso negativos: - mudança de fenótipo, ganho ou perda de antígenos - alteração do fenótipo em recaída - casos de LMA - fenótipo semelhante ao normal Falso positivos: - subgrupos de células normais que expressam fenótipos incomuns
64 2 P fundamentais Protocolos clínicos Padronização técnica dos percentuais EVOLUÇÃO
65 CITOMETRIA DE FLUXO EVOLUÇÃO NOVOS EQUIPAMENTOS NOVOS FLUOROCROMOS NOVOS PAINEIS DE ANTICORPOS NOVOS PROGRAMAS DE AQUISIÇÃO NOVOS PROGRAMAS DE ANÁLISE NOVOS MÉTODOS DE ANÁLISE NOVOS PARADIGMAS NOVAS MANEIRAS DE DETECTAR DRM EVOLUÇÃO DO TRATAMENTO
66 Pesquisar DRM é procurar argutamente algo que não sabemos se existe, numa imensidão que parece não ter nada.
67 HOSPITAL DE CLÍNICAS DA UFPR OBRIGADA EQUIPE DE IMUNOFENOTIPAGEM Agradecimentos:Dr. Alberto Orfao GDT International Nature Photography Festival/Markus Varesvuo Ana Paula de Azambuja Edna Martins Eliana L Lima Elisa Novello Juli Pimentel Maria Tadeu L Rocha Miriam P Beltrame Noeli T Silva
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