PROTOCOLO CITOMETRO DE FLUXO

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1 PROTOCOLO CITOMETRO DE FLUXO Prof. Enrique R. Argañaraz Lab Virologia Molecular Faculdade de Ciências da Saúde Universidade de Brasília

2 FLUXOGRAMA Iniciar Sistema Controle de Qualidade Ajustar Parâmetros Gravar Dados Analisar Dados Desligar Sistema I. Iniciar Sistema 1. Ligar o aparelho na seguinte ordem: Ligar o aparelho na seguinte ordem: Ligar estabilizador. Ligar o Citômetro de Fluxo. Ligar o Computador; deixar 5 a 1 (para atingir máxima potência) 2. Checagem de Reservatórios Vasilhame de Descarte gaveta esquerda (descartar o liquido e acrescentar 5-1 ml hipoclorito concentrado) - Observar se está em Standby (Só assim o equipamento está pronto para uso). Vasilhame FACS FLOW Verificar pressão ( puxar alavanca em direção ao operador) 1. Apertar bem a tampa 2. Encaixe do tubo Nota: Não esquecer de desligar a pressão ante de abrir o vasilhame Apertar RUN e HIGH Objetivo: para que o sistema se complete com o FACS flow novo. Nota: monitorar ate ausência de bolhas na mangueira (tirar a mangueira do filtro e tirar as bolhas) Se as bolhas não desaparecerem, apertar HIGH e PRIME esperar voltar a Stanby. Objetivo: tirar bolhas e a solução velha. 3. Abrir o programa Cell Quest Pro. Fechar a folha em branco Untitle (Don t Save). Abrir a planilha, pode estar pronta : File Open Document Abrir a Planilha de Aquisição Open. File Document Size Criar uma Folha. 4. Conectar o computador ao aparelho: Acquire Connect to Cytometer (maçã + B) Ao conectar, a janela do Browser aparece automaticamente (Parameter Description).

3 Figura 1 Ao conectar o computador ao FACS aparecerá o menu aquisição Aquisição control Figura 2 5. Número e Tipos de Eventos que serão Adquiridos) Clicar em Acquire mais uma vez; Clicar em Aquisição and Storage aparecerá menu abaixo Figura 3

4 Neste menu se podem escolher os critérios para salvar e exibir os eventos. Aquisição Gate : quais eventos serão salvos ou rejeitados, os eventos podem compor uma dada população (morfologica ou fenotípica) Nota: em geral se deixa como All para ter salvos todos os eventos e excluir apenas na análise Collection Criteria : se define com que números de eventos a aquisição será encerrada ( seja de eventos totais ou uma dada população); Storage Gate: os eventos que serão salvos se aconselha deixar em All ; Resolution: selecionar o valor 256 ; Parameters saved : quais parâmetros serão salvos. Devem ser selecionados FSC, SSC ( morfologia, tamanho) e as fluorescências Figura 4 6. Identificação das Amostras ( nome e destino dos arquivos) Ao conectar o citômetro aparecera automaticamente o menu abaixo Figura 5

5 Folder: em que pasta serão gravados os dados, ex iniciais do operador. custom prefix mudar para simple ID File name prefix: nome do experimento File name suffix: se mantido enumerará de forma crescente Figura 6 Ainda no parametr description se repete no item Sample ID: o nome do tubo ex. Mock; Se deve colocar dos eixos dos gráficos: P1-FSC; P2-SSC; P3-FL1; P4-FL2; P5-FL3. Pode-se ainda se escolher outros eixos ex anti-cd3 FITC ao invez de FL1, como nome do eixo P1. Nota: é possível só se existe um tipo de Ac conjugado a FITC. Fechar, não tem ok 7. Abrir as 4 janelas (maça 1,2,3,4) ou Cytometer abrir as seguintes janelas: i. Detectors/Amp (maçã + 1) (mudar para log FL1,2 e3) ii. Threshold (maçã + 2). iii. Compensation (maçã + 3). iv. Status (maçã + 4) v. Instrument Settings Open Procurar uma Compensação (Feita com as Beads ou CD3-CD4-CD8) Set Done. Figura 7

6 Detectors/ Amp: FSC e SSC devem ser mantidos em Linear e as fluorescências em Log; Pode-se ligar o seh]gundo laser four color (635 nm-vermelho) Compensation usado se houver 2 ou mais marcações Threshold: usado para tirar debris 8. Na pagina principal abrir Plot Figura 8 Em Plot Source : selecionar Axquisition e em seguida parecerão X e Y parameters que foram previamente selecionados parameters saved ; Escolher os eixos desejados: ex para 3 fluorescencias FSC x SSC; FL1 x FL2, FL1 x FL3 e FL2 x FL3. Pode-se escolher No Gate ou apenas os eventos que interessam, selecionando uma região de interesse. Nota: Mesmo que selecione um gate todos os eventos estarão sendo salvos como determinado em Aquisição & Store Para abrir Histogramas selcioanr plots e depois Histogram Neste ponto poderá ser adquiridas as amostras controles para ajustar os parâmetros. Sempre com o item Setup selecionado Figura 2

7 II. Ajuste de Parâmetros ( Settings) Deve ser seguido o roteiro abaixo Passos da otimização Amostras para otimização A. Ajustar as voltagens de FSC e SSC. B. Ajustar threshold. C. Seleção de população de interesse gate. D. Ajustar as voltagens dos PMT. E. Compensação. Controle Não Marcado Controle com FITC Controle com PE Controle com PerCP A. Ajuste de morfologia - Passar a amostra Mock e no plot de Foward / Side- Sacatter; - Mexer no Detector / Amp para distribuir a população e distinguir as diferentes populações, vide exemplo Figura 9 - Em A a voltagem SSc esta muito alta e B a de FSC esta alta, permitindo a aquisição de debris o que diminuirá os eventos plauciveis de serem analizados. - A voltagem de FSC deve ser mantida em E e como em B tem muito debris o valor de FSc deve ser diminuído ou mesmo para SSC, até ficarem satisfatórios como figura abaixo. Figura Neutró filos Monócit os Linfócito s

8 B. Ajustar o Threshold -Exclusão do Debris Existem duas formas de excluir o debris: a) Baixar a voltagem do FSC b) Aumentando o Threshold, até que o debris deixe de ser visualizada 1 Em qual parâmetro usa-se o treshold? 8 SSC-H DEBRIS 4 6 FSC-H 8 1 Figura 11 C. Seleção de população de interesse gate. D. Ajuste de voltagens (FSC e SSC) Fazer gate na população de interesse e ajustar as voltagens dos PMT. Objetivo: evitar falso positivo e falso negativo células não marcadas como controle Sem ajuste Com ajuste

9 E. Compensação- Vazamento Muitas fluorescências apresentam superposição-vazamento para outros canais, pelo que tem que ser realizada a compensação Sobreposição de Espectros a) Passar os controles (+) para cada fluorescência e compensar, ou seja aumentar as diferencias entre as fluorescencias para tirar o vazamentoi-sobreposição das fluorescencias. Compensação do FITC ( +FITC/-PEC) FITC 53/3 PE 585/42 Sem ajuste PERCP 67nm Com ajuste Relative Intensity. Aumente o valor 5n m 55n 6n 65n Wavelength m m (nm) m 7n m

10 Compensação PEC (- FITC/+ PEC) FITC 53/3 PE 585/42 PERCP 67nm PE-Cy7 78/6 Sem ajuste Com ajuste Relative Intensity 1.2 Aumente o valor Compensação (-FITC / - PEC) Ajustar as populações para que a população fique no quadrante duplo negativo. Wavelength (nm) Salvar Aquire ---- Adquisição store: - definir R1 e o número de eventos Parâmeter description--- Sample ID---nome de cada tubo passar os controles novamente clicando no settting para que grave Onde os valores de parâmetros ficam armazenados? II. Aquisição das Amostras c) Salvar Aquire ---- Adquisição store: - definir R1 e o número de eventosparâmeter description--- Sample ID---nome de cada tubo

11 Apêndice I. Calibração automática por beads - FACS comp. 1. Preparar os seguintes tubos a) 1 ml de FACS Flow + 1 gota de beads não marcados b) 3 ml de FACS Flow + 1 gota de cada fluorescência 2. Abrir o FACS Comp a) defenir o tipode célula: se é lavada ou não b) Códigos: colocar os códigos de cada beads c) Se vai se gravar ou não II. Para puxar uma calibração anterior a) Uma calibração anterior Abrir Citometer---- Instrument setting---open----puxar a calibração anterior b) Calibração do FACS Comp Abrir FACS station-----bd files---- Instrument setting----calibration files Open--- set----done III. Imprimir relatório Abrir FACS station-----bd files ---FACS comp files--- Pasta do dia---- cliques OBSERVAÇOES IMPORTANTES Limpeza do filtro de ar. Lavar periodicamente com detergente neutro, deixando ele secar e recolocando na grade do filtro, sempre lembrando com a proteção metálica para baixo. Limpeza do tanque de isoton Para a retirada da sonda tomar cuidado para não rodar toda a sonda, rodar somente a parte branca que envolve a sonda, pois pode levar a quebrar o fio que leva a informação para o aparelho se o isoton esta cheio ou vazio Nível dos tanques A importância de verificar o nível dos tanques: se o isoton estiver abaixo do nível mínimo a coluna de ar será maior que a de líquido, levando a adquirir muito ar podendo prejudicar as amostras. Enchendo o tanque de isoton No momento em que for encher o tanque de isoton tomar cuidado com a limpeza do funil e do Becker, que poderá a levar a cair partículas de sujeira que

12 acarretara no mal uso do citômetro podendo levar ate o entupimento do aparelho. Tanque de waste O tanque de waste quando estive cheio descartar na pia, e depois colocar 1ml de hipoclorito concentrado e levar de volta ao citômetro. Kit básico É importante ter um kit básico na sala de citometria, que é composto por um esguicho de água bi destilada,de hipoclorito a 1% e outro de isoton, com uma observação importante, o hipoclorito não pode ficar em um frasco transparente por que só ira durar 1 dia e a água tem que ser trocada diariamente por que pode criar alga. Entupimento do citômetro Caso ocorra o entupimento do citômetro, temos 3 procedimentos que poderíamos fazer para resolver. O 1ª é dando o prime no próprio aparelho com a água no SIP, este procedimento ira provocar uma pressão para o lado de fora do SIP tentando limpar o sugador. 2ª passo é usando uma seringa com um cano de plástico que ira ligar ao SIP que através da pressão exercida que será maior que a do prime para o desentupimento do SIP. 3ª passo utilizando um fio muito fino que colocaremos dentro do SIP e empurrando de um lado e puxando do outro para desobstruir o SIP.

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