Aplicações da Citometria de Fluxo no diagnóstico oncohematológico

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1 Aplicações da Citometria de Fluxo no diagnóstico oncohematológico Dra. Nydia Strachman Bacal Hematologista e Patologista Clínica

2 Aplicações da Citometria de Fluxo no diagnóstico oncohematológico Dra. Nydia Strachman Bacal Hematologista e Patologista Clínica

3 Essas partículas estão suspensas em meio líquido

4 Sistema que gera um fluxo contínuo laminar de partículas, que passam uma a uma frente a um feixe de laser CÂMERA DE FLUXO FOCO HIDRODINÂMICO LASER Orifício Orifício com com Diâmetro: a µm µm

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9 Fotomultiplicadores FSC Sensor Impulsos elétricos Sinais analógicos Sinais digitais Freq Fluorescence Distribuição por frequência Histogramas Detector de Fluorescência (FL1,FL2, FL3 e FL4) (tubos fotomultiplicadores)

10 APC 633, Cy5 633, Lasers - Fluorocromos Fluorocromo Laser (nm) Emissão (nm) FITC R-PE (PE) Pe-Cy5 (TC1) PerCP (BD2) PerCP/Cy5.5 (BD) AAD Iodeto de propidium Texas Red

11 Citometria de Fluxo Imunofenotipagem Análise da expressão antigênica das células através da ligação antígeno anticorpo - fluorocromo Anticorpos monoclonais designados CDs Clusters of differentiation ligam-se as células nos determinantes antigênicos ou epítopos em sua membrana, citoplasma e intranuclearmente.

12 Citometros de Fluxo - Fluorocromos XL FC FACSCanto FACSalibur FACScan CYAN Alexa450 Alexa405 APC-Cy7 APC/Cy5 PE-Cy7 PE-Cy5.5 PE-Cy5 PE-TR PE FITC

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17 ALGUMAS APLICAÇÕES CLÍNICAS ATUAIS Análise do conteúdo de DNA Quantificação de reticulócitos Análise da Subpopulação Linfocítica Diagnóstico e acompanhamento de Leucemias e Linfomas Diagnóstico e acompanhamento de Mieloma Multiplo Mielodisplasia / Doenças Mieloproliferativas Diagnóstico de Hemoglobinúria Paroxística Noturna Detecção de Anticorpos Antiplaquetários Disfunção plaquetária Quantificação de células progenitoras (stem cell) Detecção de Células Neoplásicas não hematopoéticas Monitoramento Quimioterapia / Doença Residual Mínima Avaliação imunológico de paciente transplantado e de infusão linfocitária Outras aplicações : Estudos da função celular, Apoptose, MDR (Múltipla Resistência à Drogas), Procedimentos em Hemoterapia (Detecção de Anticorpo em Anemia Auto-imune, Detecção de hemorragia feto materna, Controle de Qualidade de Leucodepleção, etc...), HLA-B27, Teste de Antígeno Leucocitário (HLA) e Cross Match.

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25 Análise da Subpopulação Linfocítica IMUNODEFICIÊNCIA ADQUIRIDA Anti-CD3 PerCP Anti-CD8 PE Anti-CD4FITC Anti-CD3 PerCP Anti-CD16 /CD56PE Anti-CD19 FITC

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27 Aplicações: Monitorar Imunodeficiência Adquirida (AIDS) Imunofenotipagem de Linfomas Imunofenotipagem de Leucemias Monitorar transplantes Monitorar sistema imunológico Função plaquetária

28 Estratégia de Gates janelas 1. FS x SSC tamanho x granularidade 2.CD45 x SSC 3. Gates sequenciais CD19 CD3 CD138 CD34

29 EXPRESSÃO DO CD45 em Leucemia Aguda

30 Diagnóstico e acompanhamento de Leucemias, Linfomas e Mieloma Leucemias agudas Linfóides x Mielóides Leucemias Crônicas Linfocítica, Mielomonocítica Linfomas leucemizados Discrasia de Células Plasmáticas

31 Diferenciação Granulocítica MO normal Painéis de anticorpos monoclonais I II III IV V Mieloblasto Pro- Mielócito Meta- Neutrófilo mielócito mielócito Bastão CD34 CD117 HLA-DR CD13+forte CD33+forte CD117 CD13+forte CD33+forte CD15 CD13+fraco CD33+fraco CD15 CD11b CD13+ CD33+fraco CD15 CD11b CD16 CD13+forte CD33+fraco CD15 CD11b+forte CD16+forte CD34/CD117/CD45/CD13.33 Dra.Silvia Ines Pires Ferrreira Hemosc/ Sta Luzia -SC CD16/CD13/CD45/CD11b

32 LMA M3 CD45xSS CD2xCD45 HLA-DRxCD45 CD34xCD45 MPO(c)xCD45 CD56xCD45 CD33xCD45 CD13xCD45 CD117xCD45 CD71xCD45

33 Diferenciação Linfóide B MO Normal Painéis de anticorpos monoclonais I II III IV V Pró B Pré-pre-BI Pré-pre-BII Pré-pre-BIII Madura Plasmática CD34 TdT CD34 TdT CD10+forte (TdT) CD10+forte imatura CD10+fraco B IV CD19 CD19 CD19 CD19 CD19 CD22 CD22 CD22 CD22 CD22+forte CD45+fraco CD45+fraco CD45 CD45+forte CD45-/+ CD20+fraco CD20 CD20+forte Cit Igµ Cit Igµ Cit Igµ IgM sup. IgM sup. TdT/CD20/CD19/CD10 CD34/CD22/CD19/CD45 sigĸ/sigλ/cd20/cd10 Marcações Alternativas Cit Igµ/ Igµ sup /CD20/CD10 Dra. Silvia Ines Pires Ferrreira Hemosc/ Sta Luzia - SC

34 LLA B MADURA LINFOMA DE BURKITT CD45xSS TdTxCD19 CD34xCD45 CD20xCD45 CD22xCD45 KAPPA(sup)xCD19 CD19xCD45 HLA-DRxCD45 CD10xCD45 IgM (sup)xcd19

35 ASF, 28a LMA M0 P.O. 32a LMA M0

36 LLC- B: Células linfóides B com restrição de cadeia leve monoclonal para kappa baixa expressão e expressão antigênica de CD5+ e CD20+ baixa expressão

37 Leucemia de Células Cabeludas - Hairy cell

38 Mieloma Múltiplo

39 Mieloma Múltiplo Histograma de Tamanho x Complexidade Histograma CD138 x Complexidade

40 Mieloma Múltiplo Histograma de Monoclonalidade em Kappa intracitoplasmática

41 Mieloma Múltiplo CD56 x CD138 CD19 (-) nas células CD138 (+)

42 Mieloma Múltiplo Histograma CD45 x CD138 Histograma HLA-DR x CD138

43 Mieloma Múltiplo Histograma de Conteúdo de DNA com Hiperdiploidia

44 Mielodisplasia PAPEL DA IMUNOFENOTIPAGEM POR CITOMETRIA DE FLUXO Técnica complementar / análise dentro de um contexto Quantificar blastos de forma exata Discriminar Mieloblastos de Promielócitos e dos Pró-monócitos Estudo de mudanças fenotípicas na MDS

45 M.O normal

46 Normal: CD34:2% MO nl

47 SÍNDROME MIELODISPLÁSICA FENÓTIPO ALTERADO QUALITATIVAMENTE Expressão antigênica assincrônica CD34/CD15/HLA-DR(-) Expressão antigênica diminuída ou aumentada CD45 fraca em Monócitos CD33 intenso / HLA-DR(+) em Neutrófilos Coexpressão aberrante CD56 em monócitos /CD2 ou CD19 em linhagem granulocítica FENÓTIPO COM ALTERAÇÕES NUMÉRICAS Linhagem celular ou maturação Aumento de células CD34(+) - mielóide, aumento de células monocíticas e eritróides e diminuição de neutrófilos M.C.DelCanizo et al Immunophenotypic analysis of myelodysplastic syndromes Haematologica/Journal of hematology vol.88(04):april 2003

48 MYELOBLAST PROMYELOCYTE MYELOCYTE META- MYELOCYTE BAND/ NEUTROPHIL CD CD13 CD33 CD15 CD11b CD CD65 CD64 CD CD16 CD34 HLA-DR CD117 CD54 Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas Florianópolis - Setembro de 2004

49 MYELOBLAST PROMYELOCYTE MYELOCYTE META- MYELOCYTE BAND/ NEUTROPHIL CD CD13 CD33 CD15 CD11b CD CD65 CD64 CD CD16 CD34 HLA-DR CD117 CD54 Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas Florianópolis - Setembro de 2004

50 HPN - Hemácias Ausência de expressão antigênica do CD59 em 34,9% das células identificadas por Glicoforina A Ausência de expressão antigênica do CD55 em 46,5% das células identificadas por Glicoforina A

51 HPN - Neutrófilos Controle normal: CD55(+) = 99,8% Ausência de expressão antigênica do CD55 em 97,7% dos neutrófilos.

52 HPN - Neutrófilos Controle normal: CD59 (+) = 100,0% Ausência de expressão antigênica de CD59 em 82,7% das células identificadas pelo CD13.

53 HPN - Monócitos Controle normal: CD14(+) = 99,8% Ausência de expressão do CD14 em 98,3% das células CD 64 (+)

54 Pesquisa de Anticorpo Anti-plaquetas Método Direto Total de casos 115 pacientes com plaquetopenia. Amostra: 10 ml de sangue em EDTA. Equipamento: Citômetro de Fluxo EPICS XL-MCL da Beckman Coulter Material: Método: - Anti-Human IgG FITC conjugate SIGMA (F-1641) - CD41 ou CD61 PE Immunotech (PN IM1416) - Tampão PBS-EDTA As Plaquetas separadas do sangue total coletada em EDTA, são lavadas e marcadas com CD41PE e IgG FITC e analisadas no Citômetro de Fluxo. João Carlos C. Guerra, MD, Ruth H Kanayama, PhD, Sonia S.Nozawa, PhD, Márcia R. Ioshida, PhD, Irina Y Takiri, PhD, Robson J. Lazaro, PhD, Nelson Hamerschlak, MD, Luiz Gastão M. Rosenfeld, MD, Celso Carlos C. Guerra MD and Nydia S. Bacal, MD. Low Platelet Counts: Diagnosis Using Flow Cytometry and Anti Platelet Antibody Blood (ASH Annual Meeting Abstracts) : abstract 3966.

55 Controle Negativo Plaquetas /mm³ CSM, 20 anos,masc. Plaquetas /mm³ CSM

56 AVS AVS, 31 anos, fem. Plaquetas /mm³

57 O antígeno está ausente ou presente em baixa expressão em pacientes com Síndrome de Bernard-Soulier é identificado pelo anticorpo CD42b que é específico para a glicoproteina plaquetária GPIb Essa glicoproteina plaquetária serve como receptor para o Fator Von Willebrand e tem alta afinidade ao receptor de trombina. CD42a(GPIX), CD42d(GPV) raramente utilizadas. CD41 (GPIIb) and CD61 (GPIIIa) Trombastenia de Glanzmann

58 Quantificação de células progenitoras CD34 (+) - Citometria de Fluxo Protocolo ISHAGE Plataforma dupla Sangue periférico Medula Óssea Aférese Cordão Umbilical

59 Marcação fluorescente ligada ao cálcio permite o estudo de ativação celular

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63 Imunofenotipagem Paineis Proliferativos - utilizados no HIAE 1. Leucose Aguda : MPO, CD79a, CD3intra e/ou CD45 x SS Primeiro passo : 2 CD por linhagem CD2-CD7 / CD10-CD19 / CD13-CD33 /CD4-CD14(My4) e CD34 / HLA-DR Conforme linhagem segue com outros Atc específicos : CD20, CD22, IgM intra, Kappa e Lambda intra e/ou sup. CD 3sup., CD38, CD5, CD8 raramente TdT CD11b, CD14(MO2), CD15, CD41,CD64, CD71, Glicoforina A, CD117

64 Imunofenotipagem Painéis Proliferativos utilizados no HIAE 2. Doenças Linfoproliferativas B CD19 (+) ou CD20(+) ou CD138 : CD5, CD10, CD11c, CD22,CD23,CD25, FMC- 7; IgM, Kappa e Lambda intra ou sup.,cd103, IgG,CD38, CD56 e HLA-DR 3. Doenças Linfoproliferativas T -CD2, CD3intra e sup., CD4, CD5, CD7, CD8, -CD11b, CD16, CD25, CD38, CD56, CD71 e HLA-DR, Outros CD disponíveis: -CD30, CD1-A, CD79b, IgG, IgD e IgA, TCRαβ/TCRγλ, Ti -gamma.

65 LEUCEMIA AGUDA Painel inicial FITC PE PE-Cy5 MPO c CD79a c CD3 c CD15 CD33 CD45 CD2 CD7 CD45 HLADR CD34 CD45 CD10 CD19 CD45 IgG1FITC IgG1PE CD45PE-Cy5 LLA-B LMA LLA T FITC PE PE-Cy5 FITC PE PE-CY5 FITC PE PE-Cy5 CD22 CD20 CD45 CD14 CD45 CD5 CD1a CD45 kappa CD19 CD15 CD13 CD45 TCR g//d TCR al/b CD45 Lambda CD19 CD71 glicofor. CD45 CD8 CD4 CD3 IgM c CD41 CD117 CD45 CD38 CD56 CD45 CD22c? CD64 CD11b CD45 CD4 CD45

66 Doenças Linfoproliferativas Crônicas Painel inicial FITC PE PE Cy-5 HLA DR CD20 CD19 CD2 CD7 CD3 IgG IgG IgG linoproliferativa B linfoprolifertativa T Plasmocitária FITC PE PE Cy-5 FITC PE PE Cy-5 FITC PE PE-Cy5 kappa CD19 CD8 CD4 CD3 CD138 CD117 CD19 Lambda CD19 CD16 CD56 CD3 CD38 CD56 CD19 CD5 CD20 CD19 CD25 CD56 CD3 CD138 CD56 CD117 CD22 CD23 CD19 CD5 HLADR CD3 CD138 CD38 CD117 FMC7 CD11c CD19 CD79b CD38 CD19 CD103* CD25* CD19* *somente p/ HCL IgM IgD IgG CD30 CD15 CD15 ** Para suspeita de Linfoma de Hodgkin ou Linfomas agressivos de grandes células, marcar com CD30 e CD15.

67 IMUNOFENOTIPAGEM PAINEL PROLIFERATIVO NOVEMBRO/1991 A JULHO/2007 PATOLOGIAS N DE CASOS LEUCEMIAS AGUDAS 1954 (31,3%) LMA 1084 (17,4%) LLA 854 (13,7%) L. Bifenotipica 16 (0,2%) NEOPLASIAS DE CÉLULAS B MADURAS 1441 (23,1%) DLPC-B/LNH-B 1238 (19,9%) NEOPLASIAS DE CÉLULAS PLASMÁTICAS 203 (3,2%) DLPC-T / NK 83 (1,3%) DOENÇAS MIELOPROLIFERATIVAS CRÔNICAS 55 (0,9%) SMD e LMMoC 79 (1,3%) Linfoma de Hodgkin 1 (0,02%) MO SEM DOENÇAS ONCOHEMATOLOGICAS, CONTROLES 2589 (41,5%) PÓS TRATAMENTOS, MO NORMAL e OUTRAS PATOLOGIAS HEMATOGONIAS 30 (0,49%) 6232 (100%)

68 Imunofenotipagem de Doenças Oncohematológicas nov/91 a julho/07 Nº total de casos analisados: 6 234

69 Diagnósticos acima de 60 casos entre os 6234 casos nov/91 a julho/07

70 OBRIGADA PELA ATENÇÃO! Nydia S. Bacal Grupo de Citometria de Fluxo do Laboratório Clínico HIAE Ana Claudia Miranda Brito Alexandra M.P. Cavalcante João Carlos de C. Guerra Sonia Tsukasa Nozawa Ruth Hissae Kanayama

71 Citometro de Fluxo- nova geração FC 500 Beckman Coulter HIAE: 35% ª geração Epics Profile II ª geração Epics XL MCL ª geração FC 500 Laboratórios Externos: 65%

72 Imunofenotipagem Linfocitária Imunofenotipagem em doenças oncohematológicas Quantificação de células CD34+ Pesquisa de HPN Avaliação de disfunção e ativação plaquetária Analise do conteúdo de DNA

73 Fotomultiplicadores captam a fluorescência Impulsos elétricos/ Sinais analógicos Sinais digitais Distribuição por frequência/ Histogramas R1

74 Fenotipos alterados Síndrome Mielodisplásica Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas Florianópolis - Setembro de 2004 Anormalidades Stetler-Stevenson et al Wells et al Imunofenotípicas Blood, 2001 Blood, 2003 Mieloblastos Números anormais 24/42 (53%) 72/115 (62%) CD2+ 12/45 (27%) NR Maturação de neutrófilos: SSC anormal 35/45 (84%) 9/115 (8%) CD45Be NR 4/115 (3%) Padrão anormal CD13/CD16 21/27 (78%) 27/115 (23%) Relação anormal HLADR/CD11b NR 6/115 (5%) Padrão anormal CD11b/CD16 19/27 (70%) NR Desvio à esquerda assincrônico NR 26/115 (23%) CD56+ 7/33 (21%) 18/115 (16%) CD33- NR 6/115 (5%) CD34+ NR 7/115 (6%) Presença de Ags linfóides 17/45 (38%) 4/115 (3%)

75 Fenotipos alterados Síndrome Mielodisplásica Dr Alberto Orfao - Contribuição dos Estudos Imunofenotípicos na caracterização das Síndromes Mielodisplásicas Florianópolis - Setembro de 2004 Anormalidades Stetler-Stevenson et al Wells et al Imunofenotípicas Blood, 2001 Blood, 2003 Células Monocíticas SSC anormal NR 1/115 (1%) CD13- ou CD16- NR 1/115 (1%) Relação anormal HLADR/CD11b NR 5/115 (4%) CD56+ 11/33 (33%) 19/115 (17%) CD33- or CD14- NR 3/115 (3%) CD34+ NR 14/115 (12%) Presença de Ags linfóides NR 38/115 (33%) Células Eritróides CD71 alterado, GphA ou CD45 34/44 (77%) NR Células Megacariocíticas Número aumentado 26/44 (59%) NR