Estabelecendo a linhagem das leucemias agudas. Elizabeth Xisto Souto

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1 Estabelecendo a linhagem das leucemias agudas Elizabeth Xisto Souto

2 Médica hematologista do Hospital Brigadeiro Responsável médica pelo setor de Citometria de Fluxo São Paulo Laboratório DASA Foco de atuação: Leucemias Agudas, Síndromes Mieloproliferativas e Síndromes Mielodisplásicas

3 Caso clínico Paciente do sexo feminino, 72 anos Fraqueza há 2 meses. Hb (g%) 8,5 Ht (%) 25,3 GB (/mm3) 3000 Neutrófilos (/mm3) 540 Blastos (%) 20 Plaquetas (/mm3) Mielograma Medula óssea normocelular, com presença de 55,0% de células blásticas de pequeno a médio tamanho, nucléolos visíveis, citoplasma escasso, agranular.

4 Morfologia e Citoquímica Leishman POX

5 Imunofenotipagem por citometria de fluxo Marcadores de Imaturidade

6 Imunofenotipagem por citometria de fluxo Marcadores Mielomonocíticos

7 Imunofenotipagem por citometria de fluxo Marcadores linfóides B e T

8 Imunofenotipagem por citometria de fluxo Marcadores Eritrocíticos, Megacariocíticos, NK, Plasmocitários, de Células dendríticas

9 São características imunofenotípicas encontradas na maioria das leucemias agudas : 1- CD45 de alta intensidade, CD34-, HLA-DR- 2- CD45 de alta intensidade, CD34+, HLA-DR+ 3- CD45 de moderada intensidade, CD34-, HLA-DR- 4- CD45 de moderada intensidade, CD34+, HLA-DR+

10 Qual alternativa abaixo é falsa: 1- CD13, CD33 e CD117 são antígenos específicos da linhagem mielóide 2- A MPO é marcador específico da linhagem mielóide 3- O CD3 é marcador específico da linhagem linfóide T 4- Os marcadores CD19, CD22, CD79a citoplasmático são marcadores associados à linhagem linfóide B

11 Com base nas características morfológicas, citoquímicas e imunofenotípicas apresentadas, qual a conclusão diagnóstica? 1- Leucemia Mielóide Aguda, provável subtipo FAB M0 2- Leucemia de Células Dendríticas Plasmocitóides 3- Leucemia Aguda Indiferenciada 4- Leucemia Aguda Mista

12 Estabelecendo a linhagem das leucemias agudas

13 Estabelecendo a linhagem das leucemias agudas FAB, 1985, 1991 Morfologia e citoquímica EGIL, 1995 Morfologia, citoquímica e imunofenótipo Classificações OMS, 2001 e 2008 Morfologia, citoquímica, imunohistoquímica, imunofenótipo, citogenética, biologia molecular.

14 Estabelecendo Linhagem das Leucemias Agudas LLA EGIL, 1995 B: pelo menos 2 destes marcadores da linhagem B : CD19, CD79a cito ou CD22 T: CD3 de citoplasma ou de membrana LMA 2 ou mais marcadores mielomonocíticos: anti MPO, CD13, CD33, CDw65 e/ou CD117

15 Estabelecendo Linhagem das Leucemias Agudas Classificação das LMAs 1- Linhagem mielomonocítica: anti-mpo, CD13, CD33, CDw65 e/ ou CD Linhagem eritróide ( eritroide pura, M6): Imatura: não classificável por marcadores Madura: anti-glicoforina A 3- Linhagem Megacariocítica (M7): CD41 e/ou CD61 (membrana ou citoplasma) 4- Mielóide precoce(m0): somente definida por marcadores. Imunofenótipo semelhante ao dos subtipos de LMA, mas citoquímica negativa e marcadores linfóides (CD3, CD79a e CD22) negativos. 5- LMA TdT+ EGIL, LMA com expressão de marcadores linfóides ( LY+AML )

16 Estabelecendo Linhagem das Leucemias Agudas EGIL, 1995 Classificação da LLA LLA B *(CD19+ e/ou CD79a + e/ou CD22+) Pro B (B-I) Sem expressão de outros marcadores de diferenciação B Comum (B-II) CD10+ Pré B (B-III) IgM citoplasmática Madura (B-IV) Kappa ou Lambda de superfície ou citoplasmática LLA T **(CD3 citoplasmático ou superfície) Pró T (T-I) CD7+ Pré T (T-II) CD2+ e/ou CD5+ e/ou CD8+ Cortical (T-III) CD1a+ Madura (T-IV) CD3 superfície, CD1a- α/β+ (grupo a) anti TCR α/β+ γ/δ + (grupo b) anti TCR γ/δ + LLA com expressão de antígenos mielóides ( My+LLA ) * Pelo menos 2 destes 3 marcadores. Maioria dos casos são TdT+, HLA-DR+, exceto B-IV que é TdT ** Maioria dos casos TdT+, HLA-DR-, CD34-, mas estes marcadores não são considerados para diagnóstico ou classificação.

17 Estabelecendo linhagem das Leucemias Agudas Classificação OMS LLA-B: CD19, CD79a citoplasmático, CD22, nenhum é considerado específico. Positividade em combinação ou alta intensidade estabelece linhagem. LLA-T: Somente CD3 é considerado linhagem específico. LMA: Não especifica quantos marcadores associados a linhagem mielóide devem ser positivos para a classificação. MPO único marcador considerado linhagem específico. Dificuldade diagnóstica : diferenciação de M0 e indiferenciada. M0: CD13 e/ou CD117, CD33 em 60% dos casos. MPO negativa na citoquímica e geralmente negativa ou positiva em pequena porcentagem dos blastos (CF e IHQ).

18 Leucemias Agudas de Linhagem Ambígua

19 Sistema de Escore para definição de leucemias bifenotípicas agudas (LBA)* EGIL, 1995 Pontos** Linhagem B Linhagem T Linhagem Mielóide 2 CD79a CD3 (cito ou sup) Anti - MPO IgM cito Anti TCR α/β (anti lisozima) *** CD22 cito Anti TCR γ/δ 1 CD19 CD2 CD13 CD10 CD5 CD33 CD20 CD8 CDw65 CD10 0,5 TdT TdT CD14 CD24 CD7 CD15 CD1a CD64 CD117 *LBA é definida quando o escore for maior que 2 para mielóide e 1 para linhagem linfóide ** Cada marcador pontua o correspondente peso. *** Especificidade sendo avaliada.

20 Leucemias Agudas de Linhagem Ambígua (LALAs) Classificação OMS 2001, 2008 Leucemia Aguda Não Diferenciada Leucemia Aguda de Fenótipo Misto Uma população blástica com comprometimento com mais de uma linhagem Duas ou mais populações blásticas distintas que apresentam diferentes comprometimentos de linhagem Outras LALAs

21 Leucemia Agudas de Linhagem Ambíguas (LALAS) Classificação OMS 2008 Categoria Leucemia Aguda Não Diferenciada Leucemia Aguda de Fenótipo Misto B/Mielóide NE Leucemia Aguda de Fenótipo Misto T/Mielóide NE Leucemia Aguda de Fenótipo Misto NE Tipos raros Leucemia Aguda de Fenótipo Misto com t(9;22)(q34; q11.2) ; BCR/ABL Leucemia Aguda de Fenótipo Misto com t(v;11q23); MLL Outras LALAS Critérios Diagnósticos Blastos não preenchem critérios para nenhuma linhagem hematopoética Blastos preenchem critérios para linhagem linfóide B e mielóide* Blastos preenchem crítérios para linhagem linfóide T e mielóide* Leucemias de fenótipo misto não relacionadas acima: T/B; T ou B/mielóide não monocítica de linhagem que não expressa MPO (ex etritrocítica ou megacarioblástica) * Blastos apresentam t(9;22)(q34;q11.2) com BCR/ABL1, excluindo os casos de LMC crise blástica Blastos apresentam rearranjo MLL LA não classificada como as anteriores Ou Linfoma/Leucemia Linfoblástica de Células NK ** *Que não apresentam t(9;22)(q34;11.2); BCR/ABL ou t(v;11q23);mll **Leucemias raras de classificação difícil com expressão de CD56, expressam marcadores T imaturos como CD2, CD7 ou mesmo CD3 e que não expressam marcadores linfóide B ou mielóides e apresentam os genes de imunoglobulina e receptor de células T em configuração germline e nas quais a Leuccemia de células dendríticas foi excluída.

22 Critérios para classificação de mais de uma linhagem em uma população única de blastos Linhagem Mielóide Classificação OMS 2008 Mieloperoxidase + (por CF, CQ, IHQ) Ou Linhagem Linfóide T Dois ou mais marcadores positivos de diferenciação monocítica (CD11c, CD14, CD64, lisozima ou esterase não específica) CD3 citoplasmático (em CF anticorpo deve ser específico para cadeia épsilon do CD3, IHQ: anticd3 policlonal, não é T específico) CD3 de superfície (raro na leucemia aguda mista) Linhagem Linfóide B CD19+ forte expressão, com forte expressão de mais 1 destes marcadores: CD79a ou CD22 citoplasmático ou CD10. CD19+ fraca expressão, com forte expressão de pelo menos 2 dos seguintes: CD79a, CD22 citoplasmático ou CD10 CF: Citometria de Fluxo; CQ: Citoquímica; IHQ: Imunohistoquímica

23 Estabelecendo linhagem das Leucemias Agudas Se as células anômalas não apresentam nenhum dos critérios de comprometimento com as linhagens B, T e mielóide (incluindo M6 e M7), pensar em outras linhagens celulares: Basofílica Mastocitária Dendrítica plasmocitóide Natural Killer Células não hematopoéticas

24 Diagnóstico de Leucemia Aguda Morfologia Citoquímica Beltrame, M. Modificado Perfil de expressão fenotípica de antígenos Combinação de anticorpos monoclonais Imaturidade Linhagem celular Diferenciação/ Maturação Citogenética Biologia Molecular

25 Classificação OMS, 2001 e 2008 Leucemias Agudas de Linhagem Ambígua Os fenótipos da LAs nem sempre refletem o momento específico da maturação hematopoética em que se deu a transformação leucêmica Expressão de enzimas e antígenos associados a determinada linhagem podem estar presentes em blastos de outra linhagem Identificação simultânea de populações blásticas distintas Observação de recaídas de LA com blastos de linhagem diferente da do diagnóstico Casos que não apresentam marcadores que permitam a identificação da linhagem celular Silva, MCA. Citometria de Fluxo Aplicações no Laboratório e de Pesquisa, São Paulo, Ed Atheneu, Cap13.

26 Estabelecendo a linhagem das leucemias agudas FAB, 1985, 1991 Morfologia e citoquímica EGIL, 1995 Morfologia, citoquímica e imunofenótipo Classificações OMS, 2001 e 2008 Morfologia, citoquímica, imunohistoquímica, imunofenótipo, citogenética, biologia molecular. Futuro

27 Laboratório DASA Citometria de Fluxo - SP Aldeneide Soares da Silva Alina Florentina da Silva Bianca Villas Boas Camila Fazzani Cristiany da Silva Alves Everaldo de Almeida Santiago Guilherme de Oliveira Lopes Guilherme Stoppa Silva Kelly Cristina Silvestre Lidiane Bispo de Sousa Marta Anesia Viana Renata Souza Mattos Rosiane Albuquerque de Lima Vanessa Procópio Nascimento Obrigada!!!! Ana Claudia Carramaschi Vilela Soares Aparecida de Cássia Carvalho Elizabeth Xisto Souto Felipe Vieira Rodrigues Maciel Rodrigo de Souza Barroso elizabethsouto@dasa.com.br Gerente de operação: Nelson Gaburo Junior