Visão geral da construção de uma célula recombinante e alguns exemplos de sua aplicação

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Luna Borges de Santarém
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1 Genética bacteriana Prof. Adj. Ary Fernandes Junior Departamento de Microbiologia e Imunologia Instituto de Biociências UNESP Tel ary@ibb.unesp.br

2 Visão geral da construção de uma célula recombinante e alguns exemplos de sua aplicação Genes pertencentes a uma determinada célula de um organismo podem ser inseridos e expressos em células de outro organismo. Células geneticamente modificadas podem ser utilizadas para produzir uma grande variedade de produtos úteis.

6 Replicação do DNA

7 Replicação bidirecional de uma molécula circular de DNA bacteriano

8 Replicação bidirecional de uma molécula circular de DNA bacteriano

11 Bactérias: Onde encontramos genes????????? DNA Bacteriano, Plasmídios, DNA Fágico, Transposons Replicons

12 Variações Temporárias (Sem alterações no genoma) (Alterações Fenotípicas) Morfológicas -Serratia marcescens: 37 º C sem pigmento 25º C vermelhas, -Bacillus sphaericus: 2% peptona (células vegetativas) 0,1% peptona (esporos) -Gram positivos: Culturas novas cels. azuis Cultura velhas cels. vermelhas, - Azomonas x sacarose x cápsula Fisiológicas - Produção de beta galactosidase quando tem lactose no meio (regulação gênica)

13 Variações Permanentes Com alterações no genoma) (Alterações genotípicas) Mutação e Recombinação Genética

Plasmídeos Ilhas de patogenicidade Outras E. coli -APEC -NMEC, -STEC, etc (ETEC Enterotoxigênica E. coli) E. coli comensal (UPEC-Uropatogênica E. coli) (EPEC Enteropatogênica E.

Nature Reviews Microbiology 6, 387-394 (May 2008) A absorção de elementos genéticos móveis (fagos, plasmídeos de virulência, ilhas de patogenicidade), e perda de porções de DNA-cromossômico em

14 Plasmídeos Ilhas de patogenicidade Outras E. coli -APEC -NMEC, -STEC, etc (ETEC Enterotoxigênica E. coli) E. coli comensal (UPEC-Uropatogênica E. coli) (EPEC Enteropatogênica E. coli) (EIEC Enteroinvasiva E. coli) (EHEC Enterohemorrágica E. coli) (atualmente quando só phage StxФ é STEC) Ahmed ety al. Nature Reviews Microbiology 6, (May 2008) A absorção de elementos genéticos móveis (fagos, plasmídeos de virulência, ilhas de patogenicidade), e perda de porções de DNA-cromossômico em linhagens distintas de E. coli, possibilitou surgimento de clones de diferentes patotipos de E. coli associados a sintomas de doenças específicas. LEE - locus of enterocyte effacement; PAIs - pathogenicity island; peaf - enteropathogenic E. coli adhesion factor plasmid; pent- enterotoxin-encoding plasmids; Stx - Shiga-toxin-encoding bacteriophage.

15 Variação permanente resultante de Mutação tempo 1. População de uma bactéria em processo de multiplicação minutos, horas, dias, meses 5. Os mutantes continuam com o crescimento na presença do antimicrobiano e iniciam dispersão pelo ambiente 2. Processo de crescimento e divisão produzem naturalmente células mutantes Pressão seletiva 4. Células são mortas ou impedidas de multiplicação pela antimicrobiano com exceção dos mutantes resistentes ao antimicrobiano específico. Células são expostas a um composto antimicrobiano 3. População continua multiplicação, e originando ocasionalmente, mais células mutantes

16 Variação permanente resultante de Mutação Mutação cria variação Mutação desfavorável é selecionada contra Ocorre reprodução e mutação Com a mutação favorável é provável que o mutante sobreviva......e se reproduza

17 Variação permanente resultante de Recombinação Genética 1. Duas populações bacterianas A e B crescem em um mesmo ambiente. A espécie B é resistente a droga X. 2. Troca de DNA (elementos genéticos móveis) ocorre entre células em baixa frequência. Pressão seletiva 4. Na presença da droga X, as células da espécie A que receberam gen da resistência da espécie B são capazes de multiplicar-se enquanto que as células originalmente sensíveis não multiplicam-se. Bactérias são expostas a droga X. 3. Células da espécie A recebem o gen de resistência a droga X, presente no elemento genético móvel da espécie B.

18 MUTAÇÃO Alteração brusca no material genético Alteração hereditária em uma seqüência de bases do DNA Mutante Natural (10-6 a ) Adquirida ou Induzida (Agentes Físicos e Químicos)

21 Variação S (Smooth) R (Rough) em K. pneumoniae por mutação Klebsiella pneumoniae (Aspecto mucóide (molhado) de colônias) Variação S R

22 Resistência à drogas antimicrobianas por mutação (Tipo Cromossômica) Modelo de um passo ( one step ) Bactéria sensível a estreptomicina (1 g) Mutação Resistente a 500 g

23 Modelo de vários passos ( multi step ) Bactéria sensível a Penicilina (1 g) Mutação Resistente a 10 g Mutação Resistente a 20 g Mutação Resistente a 50 g

24 Tipos de Resistência Cromossômica (dois modelos) Modelo de um passo = one step Curva tipo estreptomicina Modelo de vários passos = multi step Curva tipo penicilina

25 RECOMBINAÇÃO GENÉTICA: Doadora Receptora Moléculas distintas de DNA são combinadas numa mesma molécula, graças a um processo físico de quebra e ligação destas moléculas DNA externo = DNA Exogenoto Destinos possíveis (? )

27 TRANSFORMAÇÃO (Griffith-1928) (Reversão Pneumocócica (R S) (Rough Smooth)

29 Incorporação de DNA solúvel (Lise ou Liberação Espontânea) (Plasmídeos são passíveis de transferência também)

30 Condições para ocorrer a transformação DNA homólogo, Dupla fita e PM elevado (10 5 a 10 7 ), Meio sem DNAase Bactéria Receptora em Estado de Competência Fisiológica (DNA solúvel, Qualquer momento, Determinado estágio do ciclo celular, Condições Especiais)

31 Transformação

32 CONJUGAÇÃO (Tatum e Lederberg E.coli) Transferência através de comunicação entre as duas bactérias ( Unidirecional)

33 Conjugação bacteriana Pili (Gram negativa) Ponte de conjugação (Gram positiva)

34 Conjugação de Gram negativa

Pheromone A released from the potential recipient cell (right) interacts with plasmid A in the potential donor cell (left) to induce

35 Doadora Conjugação de Gram positiva Receptora Adaptado de Murray, B.E. (1998) Enterococcus faecalis pheromone-responsive conjugative system. Pheromone A released from the potential recipient cell (right) interacts with plasmid A in the potential donor cell (left) to induce synthesis of aggregation substance. Attachment of aggregation substance to binding substance causes the cells to clump into visible aggregates. Once the pheromone-responsive plasmid A has transferred from donor to recipient cell, synthesis of pheromone A is shut off.

36 Processo mediado por Plasmídeos (Ex. Plasmídeo R=Resistência à drogas, F=Fertilidadede, Virulência, Col, Metabólico, Críptico, etc) Obs. DNA cromossômico também pode ser transferido durante a conjugação.

37 Plasmídeo R Plasmídeo conjugativo

38 TRANSDUÇÃO ( Zinder e Lederberg ) Transferência (DNA bacteriano e Plasmídios) ocorre por meio de um vírus (Bacteriófago) Um fago infecta a célula bacteriana doadora O DNA e proteínas do fago são produzidos, e o DNA bacteriano quebrado em fragmentos. Ocasionalmente, durante a montagem do fago, fragmentos do DNA bacteriano são empacotados no capsídeo do fago. Então a célula doadora é lisada e as partículas de fago são liberados. Um fago carreando o DNA bacteriano infecta a nova célula hospedeira, a célula receptora. A recombinação pode ocorrer, produzindo uma célula recombinante com um genótipo diferente da célula doadora e da célula receptora.

39 Ciclo Lítico (vírus virulento) Ciclo Lisogênico (vírus temperado)

40 Transposon Genes Saltadores, Elementos Móveis ou Jumping genes Codificam Resistência a Drogas, Síntese de Toxinas e Enzimas Degradantes. Encontrados tanto em DNA cromossômico como em Plasmídios Tem sequência (de Inserção) que codifica enzima Transposase (Transposição ) Interfere com sequência linear do gene Mutação, Inativação ou Quebra;

41 Regulação da Expressão Gênica Evitar síntese desnecessária de metabólitos, desperdício energético, acúmulo intracelular de metabólitos tóxicos. Interação entre DNA e Proteínas Reguladoras Regulam síntese de RNAm e Atividade de enzimas específicas (Ex. Operon Lac em E.coli ( Operon Indutível); Operon Trp de E. coli (Operon repressível)

42 Operon Lac de E. coli (Operon indutível)

43 Operon Lac de E. coli (Operon indutível)

44 Operon Lac de E. coli (Operon indutível)

45 Operon Trp de E. coli (Operon repressível)

46 Operon Trp de E. coli (Operon repressível)

47 Operon Trp de E. coli (Operon repressível)

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