Genetic Resources and Biotechnology Cenargen

Transcrição

1 Genetic Resources and Biotechnology Cenargen

2 Curso PCR em Tempo Real Dr. Júlio Carlyle M. Rodrigues (Cenargen) XVIII MET Salvador, Outubro 2013 Introdução: Reação em Cadeia da Polimerase Mecanismo de replicação; Histórico; Princípios; Aplicações.

3 Replicação do DNA

4 Replicação do DNA Mecanismo de reação da DNA polimerase ataque nucleofílico OH/PO 4 ; cofatores: metais divalentes (Mg+2); energia: quebra de pirofosfato; pareamento posiciona dntp corretamente

5 PCR: histórico 1953 Watson & Crick: estrutura (1962) 1957 Arthur Kornberg: replicação e descoberta da DNA polimerase (1959) 1959 Gobind Khorana: código genético, síntese de oligonucleotídeos (1968) 1969 Thomas D. Brock: isolamento da bactéria Thermus aquaticus 1970 Isolamento do fragmento Klenow "... one would hope to obtain two structures, each containing the full length of the template strand appropriately complexedwith the primer. DNA polymerase will be added to complete the process of repair replication. Two molecules of the originalduplex should result. The whole cycle could be repeated, there being added every time a fresh dose of the enzyme."

6 1976 Isolamento de DNA polimerase de T. aquaticus 1977 Frederick Sanger Sequenciamento (1980) Pesquisa em diagnóstico Cetus Corporation, California Kary B. Mullis (1983) reação cíclica para detecção da mutação de anemia falciforme (usou princípio de Sanger e teve a idéia de colocar o 2nd primer); Cetus aplicou para patente em Março, 1985, aprovada em 1987; Cetus purificação e utilização da Taq polimerase, patente Junho 1987, aprovada em 1990; 1985 joint venture Cetus- Perkin Elmer: instrumentação; Kary B. Mullis Nobel 1993 PCR: histórico Roche compra patente por US$ ,00

7 Polymerase Chain Reaction

8 Polymerase Chain Reaction

9 Polymerase Chain Reaction simplicidade; custo; diversidade de aplicações; material biológico limitante.

10 PCR: cuidados Contaminação!!!! Bancada, primers, reagentes, pipetas preparar controles negativos/positivos; sempre uma boa idéia sequenciar produtos; desenho de primers fundamental: evitar hairpins, complementariedade (formação de dímeros). Programas: primer3 (

11 PCR: otimização MgCl 2 -altas concentrações facilitam inespecificidade, típico 1,5 mm; dntp alta concentração aumenta erro, típico 0,2 mm; concentração do molde: muito pode favorecer inespecifidade; temperatura de anelamento do primer: ponto mais crítico, quanto mais alta mais específico. Testar usando gradiente; tempo do ciclo: extensão -de acordo com tamanho do fragmento a ser amplificado (aprox. 1Kb/min)

12 Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription) análise de expressão gênica; isolamento de RNA (total ou poli-a+); síntese de cdna (transcriptase reversa); PCR com primers específicos

13 Aplicações: RACE (Rapid Amplification of cdna Ends) obtenção de cdna full length; kits (Clontech/Invitrogen); extração de RNA total; sintese de cdna (oligo-dt); adição de adaptadores nas pontas; PCR usando primers gene-específicos e primers específicos aos adaptadores; derivação: genome walking elementos regulatórios (promotores)

14 Aplicações: RAPD (Random Amplification of Polymorphic DNA) detecta polimorfismos; utilização de primers randômicos (6nt); gera marcadores moleculares; pode gerar SCAR (Sequence Characerized Amplified Region)

15 Aplicações: PCR-based diagnostic assays US$ 5,4 bilhões (2008)

16 Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription) Considerações importantes Qualidade do RNA (padronizar protocolo); Remoção de DNA; Quantificação precisa (Nanodrop + gel); Genes de referência: constitutivos/housekeeping; Controle negativo: sem template/reações de cdna sem TR; Controle positivo: gdna

17 Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription) Genes de Referência controle de quantidade inicial de molde (evitar diferenças de amplificação sejam devido à quantidades iniciais diferentes): Normalização mesmo número de cópias em todas as células; expressão em todas as células; Exemplos: gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; actina; tubulina; ubiquitina, genes ribossomais, etc.; Pode variar de acordo com tecido: TEM QUE TESTAR!!

18 Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription)

19 Aplicações: RT-PCR (Reverse Transcription) Semi-quantitativo análise na fase exponencial do PCR; usar mesma quantidade de molde; montar vários tubos da mesma reação; variar qtde de ciclos de cada reação; softwares de análise de imagem (Image J)

20 Polymerase Chain Reaction Pq PCR em tempo real? QUANTIFICAÇÃO

21 Método de detecção de produtos de amplificação: SYBR Green Vantagens: custo; sensibilidade; só liga a DNA fita dupla; não interfere na reação. Desvantagens: liga a qualquer DNA fita dupla (detecta produtos inespecíficos)

22 Método de detecção de produtos de amplificação: TaqMan probes Vantagens: especificidade; sensibilidade. Desvantagem: custo (uma sonda por reação)

23 Método de detecção de produtos de amplificação

24 PCR em Tempo Real: quantificação de expressão gênica vantagem quando o RNA é limitante; muito mais sensível que RT-PCR comum; fazer cdna com kits comerciais, testar diluições (depende do nível de expressão do gene); desenho de primers: amplicon pequeno (100 a 200 bp); Tm alto; muito cuidado com formação de dímeros! fazer amostras em triplicatas.

25 PCR em Tempo Real

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27 PCR em Tempo Real: genes de referência controle de quantidade inicial de molde (evitar diferenças de amplificação sejam devido à quantidades iniciais diferentes): Normalização mesmo número de cópias em todas as células; expressão em todas as células; repetições para ter média; Exemplos: gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase; actina; tubulina; ubiquitina, genes ribossomais, etc.; Pode variar de acordo com tecido: TEM QUE TESTAR!!

28 Passo-a-passo 1) Extração de RNA total 2) Sintese de cdna same kit, standard and optimized protocol; 3) Gene de referência; 4) Primer design parâmetros, teste com RT-PCR convencional; 5) Curva de diluição eficiência, determinar diluição para experimento, curva de dissociação (especificidade); 6) Experimento triplicata 7) Análise Delta-delta Ct 8) Data Fold change

29 Extração de RNA total time points controle rígido, padronização de tratamentos; DNAse treatment controle, primers spanning introns; integridade: gel - ribossomais; quantificação: nanodrop e gel;

30 Gene de referência testar vários; estabilidade, pouca variação (genorm); experimento: pode usar mais de um para normalização; genorm: determina estabilidade entre vários genes testados, Calcula fator de normalização - auxilia na escolha

31 Gene de referência

32 PCR em Tempo Real: genes de referência meristema flor raiz

33 parâmetros: GC 40-50%, nt, amplicon de bp cuidados: auto-complementariedade, dimerização; Primer 3 software teste com RT-PCR convencional; Determinar eficiência; Desenho de primers Curva de diluição usar cdna ou plasmídeo; determinar diluição para experimento; curva de dissociação (especificidade);

34 Desenho de primers Primer3

35 PCR em Tempo Real: correlação e eficiência dos primers

36 PCR em Tempo Real: correlação e eficiência dos primers Eficiência: E = 10 (-1/slope) 1

37 PCR em Tempo Real: curva de dissociação Desnaturação e Temperatura em que fluorescência some Depende de tamanho e sequência: utilizado para genotipagem Mais de um pico: recomenda desenho de primers novos

38 PCR em Tempo Real: quantificação por curva padrão fazer curva padrão atribuindo valores para cada ponto de diluição; quantificar amostras desconhecidas na curva padrão; correlação (r 2 ) tem que ser alta e valores das amostras dentro da curva; normalização com valores do gene de referência; Quantificação absoluta: saber número de cópias, moléculas, partículas virais

39 PCR em Tempo Real: quantificação por curva padrão

40 PCR em Tempo Real: quantificação relativa método DDCt Ct(controle)- Ct(tratamento); assume eficiência de 100% para os dois pares de primers; precisa ser validado: curva padrão; bastante utilizado, mas o Pfaffl corrige para eficiências diferentes.

41 PCR em Tempo Real: quantificação relativa formula de Pfaffl

42 PCR em Tempo Real: quantificação relativa método DDCt 2 Ct ; = 2702 pelo método Pfaffl: 1901

43 Statistical analysis programs REST (Relative Expression Software Tool) - rest.gene-quantification.info/ Corrige variações do gene de referência, entre placas, vários genes de referência

44 Statistical analysis programs

45 Q-gene

46 Aplicações PCR em tempo real Expressão gênica; Detecção de transgenes número de cópias, rastreabilidade; Diagnóstico presença/ausência, genotipagem; microrna expression; multiplex para detecção, diagnóstico e expressão

47 PCR em Tempo Real: Aplicações Transgenic detection

48 PCR em Tempo Real: Aplicações Pathogen detection Alteração da temperatura dos picos mostra fragmentos diferentes: genotipagem

49 PCR em Tempo Real: Aplicações Pathogen detection Painel de primers e alvos: presença/ausência genotipagem

50 PCR em Tempo Real: Aplicações Pathogen detection

51 Detecção e análise de expressão de microrna codificados por genes endógenos; nucleotídeos; afetam expressão de genes-alvo: bloqueio/degradação de mrna; controlam vários processos do desenvolvimento de plantas e animais; detecção por gel de acrilamida; validação de high throughput small RNA data

52 PCR em Tempo Real: Aplicações microrna expression

53 PCR em Tempo Real: Aplicações Transgenic detection Análise por Southern blot; Caro, time-consuming, método radioativo; Real-time: análise em high throughput; Método delta-delta Ct: gene endógeno com número de cópias conhecido; Planta não transformada ou previamente caracterizada

54 PCR em Tempo Real: Aplicações Transgenic detection Gene endógeno Transgene -Quantificação pode determinar número de cópias

55 Detecção de transgenes: Javdi et al. Euphytica (2010) 173: Taqman probe 1) Curva padrão Adicionar plasmideoequivalente de acordo com tamanho do genoma; Usar DNA de planta não transformada;

56 Detecção de transgenes: Javdi et al. Euphytica (2010) 173: ) Curva padrão: reação multiplex gene endógeno e transgene; TPS uma cópia por genoma; Delta Delta Ct

57 Detecção de transgenes: Javdi et al. Euphytica (2010) 173: Homozigose valores pequenos negativos, Hemizigose - valores positivos pequenos, Não transgênico valores altos negativos

58 Real-Time PCR Technology for Cancer Diagnostics Método: Taqman probes Alvo: Proteína p53

59 PCR em Tempo Real: Aplicações High Resolution Melting (HRM) analysis: Genotyping

60 PCR em Tempo Real: Aplicações High Resolution Melting (HRM) analysis: Genotyping Fibrose Cística Detecção de SNP HTR2A

61 Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2) Taq probes and primer sets

62 Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2) Variabilidade genética dificulta detecção e diagnóstico Desenvolvimento de técnica para detectar isolados virais brasileiros Metodologia Infecção controlada com amostras controle; Sondas: alinhamento e detecção de regiões conservadas; Extração de RNA total; Real time

63 Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2) well plates using the kit TaqMan Master Mix One-Step RT-PCR (Applied Biosystems): 6.1 µl of the One-Step RT-PCR Master Mix (containing AmpliTaq Gold DNA polymerase, dntps, a passive reference ROX and optimized buffer); 0.6 µl of the mixture of primers and probe(s) (415 nm primer and 85 nm probe); 0.3 µl of MuLV reverse transcriptase and RNAse inhibitor and 3 µl of total RNA (ca. 300 ng) to a final volume of 12 µl. Thermocycler StepOnePlus Real-time PCR System (Applied Biosystems) : 45ºC for 35 min (for reverse transcription), 95ºC for 10 min (activation of AmpliTaq Gold), followed by 40 cycles at 95ºC for 15 s (denaturation) and 60ºC for 1 min (annealing and extension). Presence/absence assays by determining the C T (threshold cycle). It was established that a C T value below 35 indicates a positive result. To check the efficiency and reproducibility of reactions resulting from the use of primers and probes, virus-infected control samples and samples with unknown phytosanitary status were analyzed in simplex reactions for all ten viruses evaluated.

64 Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2) Grapevine leafroll-associated virus(glrav-1, -2, -3 and -5), Grapevine virus A(GVA), Grapevine virus B(GVB), Grapevine virus D(GVD), Grapevine rupestris stem pittingassociated virus(grspav), Grapevine fleck virus(gfkv) Grapevine fanleaf virus(gflv)

65 Simultaneous detection of Brazilian isolates of grapevine viruses by TaqMan real-time RT-PCR. Dubiela et al, Trop Plant Path 38(2) Duplex detecção de dois isolados virais

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67 Análise de 6 sets de primers para detecção de 4 isolados. Qual par funcionou melhor?

68 Thanks for Your Attention! Julio Carlyle, PhD Assessor CHPD Biotecnologia Embrapa Genetic Resources and Biotechnology