Toxigenomics: Principles and aplication. Dr. André D. Luchessi
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- Maria Antonieta Caires Figueiroa
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1 Toxigenomics: Principles and aplication Dr. André D. Luchessi
2 NATAL
3 DACT - PPgCF
4 PROGRAMA DO CURSO
5 TOXIGENÔMICA
6 DEFINIÇÃO Em termos gerais toxigenômica são os estudos que envolvem a pesquisa de mecanismos ou estudos de predisposição a efeitos tóxicos.
7 GENES Toxicogenomics is not a promise for the future, it is a tool that is available to us now
8 GENOMA
9 GENÔMICA
10 A CÉLULA
11
12 VARIABILIDADE GENÔMICA
13 VARIABILIDADE GENÔMICA MARIA JOÃO PAULO ANDRÉ
14 SNPs HUMANOS
15 SNPs x DOENÇAS Anemia Falciforme
16 SNPs x DOENÇAS
17 HAPMAP
18 CYP2C9
19 CYP2C9 - HAPMAP
20 CYP2C9 - HAPMAP
21 CYP2C9 - HAPMAP
22 DADOS DE SNPs
23 POPULAÇÃO
24 RESULTADO
25 RESULTADO
26 BLOCOS HAPLOTÍPICOS
27 TAG SNPs MARIA JOÃO PAULO ANDRÉ
28 POPULAÇÃO BRASILEIRA Annu Rev Genomics Hum Genet. 2010;11: doi: /annurev-genom
29 POPULAÇÕES MISCIGENADAS Annu Rev Genomics Hum Genet. 2010;11: doi: /annurev-genom
30 MARCADORES Annu Rev Genomics Hum Genet. 2010;11: doi: /annurev-genom
31
32 A VIDA CELULAR
33 DO GENE A PROTEÍNA Luchessi AD, Curi R, Costa-Neto CM. Revealing the translation control by transcriptome analysis. Einstein Jul-Sep;4(3):237-40
34 INTERAÇÃO GÊNICA Drake et al.,mamm Genome, 2006.
35 REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO Mecanismos Organização do DNA Nucleossomos Ilhas CpG Região promotora Metilação do DNA Pré transcricional 5 CAP Splicing Cauda poli A Degradação RNAm - mirnas Transcricional Pós transcricional Formação do RNAt Pré traducional Formação cadeia peptídica Traducional
36 EXPRESSÃO DIFERENCIAL Músculo Pele Neurônio Gene A Gene B Gene C
37 CONTROLE TRANSCRICIONAL Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Alberts, B. et al
38 ORGANIZAÇÃO DO DNA DNA Recombinante. 3 ed. James D. Watson. et al
39 NUCLEOSSOMO DNA Recombinante. 3 ed. James D. Watson. et al
40 ILHAS CpG Espada J, Esteller M. Semin Cell Dev Biol DNA methylation and the functional organization of the nuclear compartment.
41 APLICAÇÃO
42 REGIÃO PROMOTORA Comparação da sequência nucleotídica da região TATA de 60 genes diferentes de vertebrados Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Alberts, B. et al Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, H. et al
43 FATORES DE TRANSCRIÇÃO Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Alberts, B. et al
44 RECOMPOSIÇÃO Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, H. et al
45 RECOMPOSIÇÃO ALTERNATIVA Molecular Biology of the Cell. 4th ed. Alberts, B. et al
46 mirna Esquela-Kerscher et al. Nature Reviews Cancer 6, (April 2006) doi: /nrc1840
47 TRADUÇÃO
48 RECONHECIMENTO AUG
49 SUBUNIDADE 60s
50 COMPLEXO 80s
51
52 PCR EM TEMPO REAL
53 APLICAÇÕES
54 PCR x TEMPO REAL Baixa precisão Baixa sensibilidade Baixa resolução Não automatizado Discriminação pelo tamanho dos fragmentos Resultados não expressos em números Amplificação pode ser monitorada em tempo real Sem processamento pós-pcr Menor quantidade de amostra Mais sensível e específica que a PCR convencional Mais reprodutível que a PCR convencional Custo/benefício
55 Log Target DNA TAXA AMPLIFICAÇÃO P = T x (1+E) n Teórico 100% = 2 n P: produto final T: template E: eficiência n: número de ciclos Real Fase exponencial alta eficiência Ciclo
56 PCR convencional x PCR em tempo real
57 EFICIÊNCIAS DE AMPLIFICAÇÃO Fatores Preparo da reação (pipetagem, bolhas) Qualidade do DNA/cDNA molde Presença de inibidores Seqüência dos iniciadores Programa de amplificação Concentração dos reagentes Tamanho do amplicon
58 O SISTEMA ÓTICO
59 UNG Enzima uracil-n-glicosilase (UNG) Amplicon gerado contém dutp Específica para deoxiuridina 50 0 C ativa; > 55 0 C inativa
60 SISTEMAS AMPLIFICAÇÃO Químicas fluorescentes existentes: SYBR Green TaqMan Molecular Beacons LUX Scorpion Probes Hybridizations Probes Etc...
61 SISTEMAS AMPLIFICAÇÃO A: Molecular Beacon; B: TaqMan Probe; C: Hybridizations Probes; D: LightUp Probe; E: Simple Probe; F: Scorpion Primer; G: Sequence non-specific dyes (SYBR Green/Boxto)
62 SYBR GREEN Intercalante de DNA dupla fita Fluoróforo em suspensão no master mix Inespecífico Permite curva de dissociação (melting) Não permite multiplex Quanto mais longa a cadeia de DNA, maior a fluorescência
63 REAÇÃO
64 GRÁFICO
65 CURVA DE DISSOCIAÇÃO
66 RESULTADO
67 GENOTIPAGEM POR HRM TM = 85 C TM = 85 C TM = 85 C TM = 83 C
68 SISTEMA TAQMAN Baseia-se na atividade 5-3 exonuclease da Taq polimerase Funciona com sondas fluorescentes Altamente específico e sensível Não permite curva de dissociação Permite multiplex
69 MARCADORES Referência Passiva: ROX Reporters: FAM NED VIC JOE HEX Quenchers: TAMRA NFQ Sonda: Localiza-se ~1-5 bases do primer sense Tm deve ser ~10ºC maior que Tm dos primers 1ª base não pode ser G (efeito Quencher) Não pode ter mais Gs do que Cs Não pode ter > 3 bases consecutivas iguais Quencher fluorescente (TAMRA) ou não fluorescente (NFQ) Pode ter ~30-40 bases (sonda TAMRA) ou ~15-20 bases (sonda com cauda MGB) junção exon-exon
70 TIPOS DE QUANTIFICAÇÃO Absoluta: unidades palpáveis, determinando número de cópias, curva standard necessária para cada gene Relativa: Análise comparativa de um gene alvo por meio dos Cts das amostras, gerando resultados relativos
71 CURVA PADRÃO
72 QUANTIFICAÇÃO RELATIVA deltact controle : = 12 deltact caso : = 7 = 1,71
73 RESULTADOS Quantificação Absoluta Fácil de entender os dados, porém muito mais caro e difícil de desenvolver os padrões de curva standard Amostra 1 Amostra 2 Quantificação Relativa Dispensa a curva standard, muito mais barato, porém mais difícil de entender os dados relativos (sem unidades) 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, Amostra 1 Amostra 2
74 GENOTIPAGEM SNP C>A C A
75 Fluorescência FAM RESULTADO TT GT Controle negativo GG Fluorescência VIC
76
77 MICROARRANJOS DE DNA Arranjos ordenados de fragmentos de DNA imobilizados sobre uma superfície sólida em alta densidade. Em geral, cada ponto no arranjo corresponde a um gene específico, podendo existir dezenas de milhares de pontos em uma lâmina.
78 SÍNTESES 1- Oligo espotado 2- Oligo sintetizado tipo Jato de tinta 3- Fotolitografia
79 SISTEMAS DE CORES
80 atch?v=mun54ecfhpw FOTOLITOGRAFIA
81 LAG/UFRN
82 ARRAY EXPRESSÃO
83 EXPRESSÃO X RESPOSTA
84 VIAS DE INTERAÇÃO
85
86 NEXT GENERATION SEQUENCING
87 ESTRATÉGIAS
88 CUSTO POR GENOMA
89 Sequenciadores
90 (R)Evolução
91 SANGER
92 SANGER
93 QUIMICA ILLUMINA
94 CÉLULAS DE FLUXO
95 INSERTO DE DNA Inserto de DNA Dois tipos de Oligos
96 HIBRIDIZAÇÃO
97 AMPLIFICAÇÃO
98 DESNATURAÇÃO
99 FORMAÇÃO DAS PONTES
100 AMPLIFICAÇÃO FITA SENSE FITA ANTISENSE
101 NOVA PONTE
102 AMPLIFICAÇÃO DAS PONTES
103 CONJUNTOS DE SEUQENCIAS
104 REMOÇÃO ANTISENSE
105 BLOQUEIO 3
106 SEQUENCIAMENTO OLIGO DE SEUQUENCIAMENTO MOLDE
107 DETECÇÃO
108 FORMAÇÃO DOS CLUSTER
109 INÍCIO
110 PRIMEIRA HIBRIDIZAÇÃO
111 DETECÇÃO
112 BLOQUEIO
113 SEGUNDA HIBRIDIZAÇÃO
114 SEGUNDA DETECÇÃO
115 SEGUNDO BLOQUEIO
116 TERCEIRA HIBRIDIZAÇÃO
117
118 FORMAÇÃO DA SEQUÊNCIA
119 RESULTADOS
120 UNIÃO DE SEQUÊNCIAS
121 SEQUÊNCIAS
122 REFERÊNCIAS ALINHAMENTO
123 ILLUMINA
124 ION TORENT
125 SISTEMA DE DETECÇAÕ
126 1000 GENOMAS
127 BROWSER CYP2C9
128 VARIAÇÕES
129 TABELA DE VARIAÇÃO
130 MISSENSE
131 DADOS
132 SEQUÊNCIAS EM FASTA
133
134
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