Curso: Marcadores Moleculares aplicados a organismos de interesse epidemiológico

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Armando da Mota Fortunato
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1 Curso: Marcadores Moleculares aplicados a organismos de interesse epidemiológico SUCEN Superintendência de Controle de Endemias São Paulo 17 a 22 de agosto de 2009

2 Aula : PCR EM TEMPO REAL José Eduardo Levi Instituto de Medicina Tropical - USP

3 POR QUE USAMOS PCR PARA DIAGNÓSTICO? SENSIBILIDADE ANALÍTICA PODE DETECTAR ORGANISMOS QUE NÃO PODEM SER ISOLADOS RAPIDEZ VERSATILIDADE DE AMOSTRAS DESVANTAGENS DA PCR CONTAMINAÇÃO REPRODUTIBILIDADE EM ALGUNS CASOS POUCA CORRELAÇÃO CLÍNICA

PODEM SER ISOLADOS RAPIDEZ VERSATILIDADE DE AMOSTRAS

4 POR QUE O PCR CONVENCIONAL NÃO É UMA TÉCNICA QUANTITATIVA? PCR SEMI-QUANTITATIVO - DILUIÇÃO SERIADA

5 POR QUE O PCR CONVENCIONAL NÃO É UMA TÉCNICA QUANTITATIVA?

6 O crescimento linear do número de cópias ocorre até um determinado número de ciclos. A saturação ocorre quando a concentração de produto amplificado atinge ~ 10-8 M ou ~ moléculas por 100 l. As causas do platô são várias: - Perda da atividade da enzima - Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA - Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do pareamento com os primers. Aumenta possibilidade de amplificação de produtos inespecíficos. - Gasto dos reagentes, especialmente inativação da DNA polimerase - Acúmulo de pirofosfato (PiPi) - Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficiência menor mas também foram se acumulando etc

As causas do platô são várias: - Perda da atividade da enzima - Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA - Acúmulo de produtos amplificados que tendem a

7 COMO SE PROCUROU VENCER ESTA LIMITAÇÃO? DILUIÇÃO SERIADA ( END-POINT DILUTION) PADRÃO EXTERNO CONTROLE INTERNO CONTROLE INTERNO COMPETITIVO

8 OS AVANÇOS : NA QUÍMICA DE FLUORESCÊNCIA NAS TÉCNICAS T DE MARCAÇÃO DE OLIGOS NOS LEITORES DE FLUORESCÊNCIA NA TECNOLOGIA DE TERMOCICLADORES REAL-TIME PCR

9 1. INTERCALANTES 1. INTERCALANTES EX. BROMETO DE ETÍDIO, SYBR GREEN, ETC. VANTAGES: SIMPLES E BARATOS DESVANTAGENS: REQUER PADRONIZAÇÃO POIS PRIMER-DIMERS TAMBÉM FLUORESCEM

11 CURVA DE MELTING TEMPERATURE C/ SYBR GREEN

13 MÉTODOS DE DETECÇÃO 2. SONDAS DE HIDRÓLISE (TAQMAN)

14 O sistema TaqMan também é utilizado para fazer discriminação e quantificação alélica

16 MÉTODOS DE DETECÇÃO 3. SONDAS FRET FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) using adjacent hybridization probes FITC Red 640 Excitation FRET Emission P Phosphate P Amplicon

17 MÉTODOS DE DETECÇÃO 4. MOLECULAR BEACONS A Excitation FRET B C Reporter Non-fluorescent Quencher ANNEALING Amplicon

18 Aplicações Detecção de agentes infecciosos Caracterização do agente (tipagem) Determinação da carga viral (quantificação)

19 Threshold Cycle CURVA DE CALIBRAÇÃO (STANDARD) Threshold Cycle = 35 Load = copies/ml Concentration log Test Sample F2/F1 1.5 Threshold Threshold Cycle Cycles

8 copies/ml Concentration log 10 2.5 Test Sample F2/F1 1.

20 Determinação da Carga 2.5 Threshold Cycle NEG 10 F2/F Cycles

21 RELAÇÃO ENTRE CARGA VIRAL E DOENÇA HIV Mellors JW Quantitation of HIV-RNA in plasma predicts outcome after seroconversion. Ann Intern Med,, 122: , 579, VIRAL COUNTS COUNT ON HIV INFECTION DAVID HO, SCIENCE DEMONSTRAÇÃO EMPÍRICA QUE A CARGA VIRAL DE HIV TEM CORRELAÇÃO COM O PROGNÓSTICO DO PACIENTE

22 CARGA VIRAL E HISTÓRIA NATURAL DA DOENÇA HIV PROGRESSORES RÁPIDOS= R 20% NÃO-PROGRESSORES = 5% 6 10 PROGRESSORES TARDIOS E INTERM. = 75% 10 2

23 Incidência cumulativa de cirrose após 11 anos de seguimento de acordo com HBV-DNA basal HBV R.E.V.E.A.L. study - Iloeje UH, et al. Gastroenterology ,5% 36,2% ,5% 5,9% 9,8% 0 < > HBV-DNA basal (cópias/ml)

24 Incidência cumulativa de HCC após 11 anos de seguimento de acordo com HBV-DNA basal HBV R.E.V.E.A.L. study - Iloeje UH, et al. Gastroenterology ,2% 14,9% 5 1,3% 1,4% 3,4% 0 < HBV-DNA basal (cópias/ml) >

25 Dengue Quais as diferenças que levam a apresentações clínicas tão distintas como a Febre da Dengue (DF) e a Febre Hemorrágica da Dengue (DHF) e a Síndrome do Choque da Dengue (DSS)? As hipóteses abordam características do hospedeiro (HLA, Nutrição estado imune) e fatores virais (sorotipo/genótipo, CARGA VIRAL)

26 Dengue

27 Dengue

28 Carga viral em Dengue

29 Carga viral em Dengue

30 Carga viral em Dengue

31 Carga viral em Dengue

32 Carga viral em Dengue

33 Carga viral em Dengue

34 Carga viral em Dengue

35 Carga viral em Dengue

36 Carga viral em Dengue DEN-1 DEN-2 DEN-3

38 HGV X HIV

39 HGV X HIV

40 HGV X HIV

41 HGV X HIV

42 HGV X HIV

43 ADRIANA FUMIE TATENO ADRIANA FREIRE MACHADO CÉLIA RODRIGUES SYNARA DE ARAÚJO JOSÉ EDUARDO LEVI ( DUDI) dudilevi@usp.br DR. CLÁUDIO SÉRGIO PANNUTI

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