Declaração de Conflitos de Interesse

Transcrição

1 Declaração de Conflitos de Interesse Nada a declarar.

2 Sala 2 - Mesa redonda A biologia viral na indução do câncer por HPV Diagnóstico laboratorial e monitorização dos pacientes com HPV - José Eduardo Levi (SP)

3 HISTÓRIA NATURAL DA INFECÇÃO POR HPV INÍCIO DA ATIV. SEXUAL HPV ALTERAÇÕES TRANSIENTES PERSISTÊNCIA RESOLUÇÃO LIE DE BAIXO GRAU LIE DE ALTO GRAU C.A. IN SITU C.A.. INVASIVO

4 FATORES INFLUENCIANDO A PROGRESSÃO DE LIE 1. TIPO DE HPV ONCOGÊNICOS X NÃO-ONCOGÊNICOS 2. PERSISTÊNCIA 3. CARGA VIRAL 4. FATORES AMBIENTAIS/COMPORTAMENTAIS DO HOSPEDEIRO IMUNOSUPRESSÃO, CIGARRO, ANTICONCEPCIONAIS HORMONAIS 5. FATORES GENÉTICOS DO HOSPEDEIRO 6. CO-INFECÇÕES CHLAMYDIA, TRICHOMONAS, HERPES

5 1. TIPO DE HPV ONCOGÊNICOS X NÃO-ONCOGÊNICOS

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7 2. PERSISTÊNCIA JAMA,2001;286:

8 2. PERSISTÊNCIA Type-Specific Persistence of Human Papillomavirus DNA before the Development of Invasive Cervical Cancer. NEJM 1999;341: Wallin, Keng-Ling; Wiklund, Fredrik; Angstrom, Tord; Bergman, Frank; Stendahl, Ulf; Wadell, Goran; Hallmans, Goran; Dillner, Joakim.

9 2. PERSISTÊNCIA Estes trabalhos demonstraram que o aparecimento das lesões é precedido de infecção persistente por um tipo de HPV A negativação do HPV-DNA indica clareamento da lesão Os tipos oncogênicos tem uma tendência muito maior de persistir que os não-oncogênicos oncogênicos

10 3. CARGA VIRAL A carga de HPV-16 aumenta de acordo com o grau de neoplasia mas a de HPV-18 não!!??

11 3. CARGA VIRAL Quanto maior a carga de HPV-16 maior o OR para CIS mas HPV-18 e HPV-31 não seguem esta regra!!??

12 VANTAGENS DO USO DO PCR SOBRE OUTRAS TÉCNICAS MOLECULARES NO DIAGNÓSTICO DE HPV 1. SENSIBILIDADE PCR É A TÉCNICA DE MAIOR SENSIBILIDADE NA DETECÇÃO DE DNA DE HPV.MAIOR VALOR PREDITIVO NEG. 2. TIPAGEM A PCR permite o conhecimento do tipo específico de HPV, seja através de PCR tipo-específico, genérico + RFLP, hibridização reversa ou sequenciamento. 3. VERSATILIDADE QUANTO AO TIPO DE AMOSTRA BIOLÓGICA Pode-se trabalhar com células esfoliadas de mucosa, biópsias, material parafinado, esfregaços corados, sangue, etc.

13 DESVANTAGENS DO USO DO PCR SOBRE OUTRAS TÉCNICAS MOLECULARES NO DIAGNÓSTICO DE HPV 1. SENSIBILIDADE POUCA CORRELAÇÃO CLÍNICA. A GRANDE MAIORIA DAS MUHERES PCR+ SÃO ASSINTOMÁTICAS E IRÃO CLAREAR A INFECÇÃO NOS PRÓXIMOS MESES. BAIXO VALOR PREDITIVO POSITIVO. CONTAMINAÇÃO! 2. REPRODUTIBILIDADE E CONTROLE DE QUALIDADE Sistemas de PCR in-house house tem menor padronização levando a variação inter-laboratorial. O controle de qualidade dos reagentes é mais complicado e menos rigoroso. 3. EXECUÇÃO Mais complexa e com mais etapas que CH, demanda maior capacitação laboratorial (equipamentos).

14 PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV) HIBRIDIZAÇÃO IN SITU

15 PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV) E5 E2 E4 L2 E1 Aprox. 8000pb L1 E7 URR E6

16 PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

17 PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV) PRIMERS MY09/11. AMPLIFICAM APROX. 450 PARES DE BASES DO GENE L1 DE CERCA DE 30 TIPOS DE HPVs. TIPAGEM POR RFLP COM 7 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO 450 pb do gene L1 dos HPVs 268 pb da ß-globina humana

18 PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV) PRIMERS MY09/11. AMPLIFICAM APROX. 450 PARES DE BASES DO GENE L1 DE CERCA DE 30 TIPOS DE HPVs. TIPAGEM POR RFLP COM 7 ENZIMAS DE RESTRIÇÃO HPV 16 HPV 58

19 PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV)

20 PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV) LINEAR ARRAY HPV Genotyping Test 37 genótipos. ROCHE RUO

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22 PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV) PCR TIPO-ESPECÍFICO EMPREGA PRIMERS QUE AMPLIFICAM APENAS UM TIPO DE HPV, UTILIZANDO COMO ALVO UMA SEQUÊNCIA ESPECÍFICA, EM GERAL DOS GENES E6 E/OU E7 ESTE SISTEMA DE PCR TEM MAIOR SENSIBILIDADE QUE O GENÉRICO, E É O IDEAL QUANDO SE QUER INVESTIGAR APENAS 1 TIPO DE HPV.

23 PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV) PCR TEMPO-REAL : EMPREGADO QUANDO SE QUER DETERMINAR A CARGA VIRAL (QUANTIFICAÇÃO). SABE-SE SE QUE QUANTO MAIOR A CARGA VIRAL MAIOR É O RISCO DE LESÃO FUTURA >NIC2 E DA PRESENÇA DE LESÃO NO MOMENTO DO DIAGNÓSTICO.

24 50 Threshold Cycle Threshold Cycle = 35 Load = copies/ml Concentration log Test Sample F2/F1 1.5 Threshold LABORATÓRIO DE VIROLOGIA Ce Threshold Cycle

25 Teste em Microarray PapilloCheck

26 Teste em Microarray PapilloCheck Canal Verde (532 nm) Canal vermelho (635 nm) 3,8 mm orientation control PCR -control hybridization control sample -control printing -control HPV-type specific probes

27 PCR PARA PAPILOMAVÍRUS (HPV) RT-PCR (REVERSE-TRANSCRIPTION PCR) O ALVO É UMA MOLÉCULA DE mrna,, CUJA DETECÇÃO IMPLICA NA EXPRESSÃO DE DETERMINADO GENE. NECESSITA DE UMA ETAPA PRÉVIA AO PCR, DE TRANSCRIÇÃO REVERSA, SÍNTESE DE cdna PODE SER REALIZADA SIMULTANEAMENTE POR ENZIMA BI-FUNCIONAL (Tth( Tth) TERIA MAIOR CORRELAÇÃO COM LESÕES E DOENÇA PreTect HPV Proofer (NORCHIP AS, Klokkarstua,, Noruega)

28 Comparision between PreTect HPV-Proofer and DNA-tests Statement (ref. no.) Identifies the primary cause of cervical cancer (E6/E7 oncoproteins) (5,6) Detects a very common infection (1,5) Identifies all sexually active women as positive once or more during their lifetime (5) Distresses a high number of women unnecessary (3,4) Minimum of false negative results (related to cervical cancer) (1) YES NO NO NO YES PreTect HPV-Proofer DNA-tests NO YES YES YES NO

29 Comparision between PreTect HPV-Proofer and DNA-tests Statement (ref. no.) Minimum of false positive results (related to healthy women) (1, 6) High Positive Predictive Value (4,8) YES YES PreTect HPV-Proofer DNA-tests NO YES

30 Comparision between PreTect HPV-Proofer and DNA-tests 1. Lie AK et. al. (2005) DNA VERSUS RNA BASED METHODS FOR HUMAN PAPILLOMAVIRUS DETECTION IN CERVICAL NEOPLASIA. Gynecologic Oncology, Volume 97, Issue 3, June 2005, Pages Walboomers et. a. (1999) HUMAN PAPILLOMAVIRUS IS A NECESSARY CAUSE OF INVASIVE CERVICAL CANCER WORLDWIDE. J. Pathol. 189: (1999) 3. ALTS group (2000) Human papillomavirus testing for triage of women with cytologic evidence of low-grade squamous intraepithelial lesions: baseline data from a randomized trial. J Natl Cancer Inst Mar 1;92(5): ALTS group (2003) A randomized trial on the management of low-grade squamous intraepithelial lesion cytology interpretations. Am J Obstet Gynecol Jun;188(6): Arbyn et. al. (2002) Triage of women with atypical or low-grade cytological abnormalities of the cervix by HPV testing. Systematic review and meta-analysis. European Network for Cervical Cancer Screening Depotnum: D/2001/2505/34, IPH / EPI REPORTS Nr Arbyn et. al (2004) Virologic versus cytologic triage of women with equivocal Pap smears: a meta-analysis of the accuracy to detect high-grade intraepithelial neoplasia. J Natl Cancer Inst Feb 18;96(4): Molden T et. al. (2005) Predicting CIN2+ when detecting HPV mrna and DNA by PreTect HPV-proofer and consensus PCR: A 2-year follow-up of women with ASCUS or LSIL pap smear. Int J Cancer Jan 11;114(6): Quality Manual - The Norwegian Cancer Registry (in Norwegian) 6. zur Hausen H. Papillomaviruses and cancer: from basic studies to clinical application. Nat Rev Cancer May;2(5): Cuschieri K et. al. (2005) Assessment of human papillomavirus mrna detection over time in cervical specimens collected in liquid based cytology medium. J Virol Methods Mar;124(1-2): Hovland S, Lie AK, Risberg B, Ryd W, Borge B, Berle E, Skomedal H, Kadima T, Batumbola L, Kyembwa ML, Bilayi E, Mukwege D, Chirimwami B, Kashongwe JP, Mvula M, Falang BM, and Karlsen F: Calculations from a High Risk Population study.

31 DR. JOSÉ EDUARDO LEVI INSTITUTO DE MEDICINA TROPICAL DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO LABORATÓRIO DE VIROLOGIA