Introdução novos casos por ano DNA microarray imuno-histoquímica (IHQ) tissue microarray (TMA) técnicas alternativas de construção de TMA

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2 Introdução No Brasil o câncer de mama é a neoplasia maligna mais freqüente, com cerca de novos casos por ano. Na última década, avanços na área da patologia molecular permitiram o reconhecimento de diferentes subtipos de carcinomas de mama, baseado em suas expressões gênicas através do DNA microarray. A imuno-histoquímica (IHQ) permite pesquisar o produto protéico desses genes e sua localização celular e tecidual e adaptar a classificação molecular, para utilização diagnóstica e em pesquisa. O tissue microarray (TMA) permite a união desses avanços, de forma ainda mais ágil e de menor custo, pois permite a avaliação de centenas de amostras em um único bloco de parafina / lâmina. Como o TMA é uma técnica comercial dispendiosa, há diversas técnicas alternativas de construção de TMA baixo custo e eficientes.

3 Objetivo Comparar diferentes classificações moleculares para o carcinoma de mama, recentemente propostas, baseadas no padrão de imuno-reatividade com os receptores de estrogênio e progesterona (RE e RP), oncoproteína Her2-neu/cerbB2 e citoqueratinas basais (CK), uma vez que existem diferenças nas definições. Estas classificações têm como objetivo reconhecer os subtipos identificados pelos perfis de expressão gênica e correlação com a evolução clínica das pacientes, particularmente o tipo basal, que tem pior prognóstico.

4 Foi construído um TMA, utilizando a técnica de Pires ARC e cols. Referência: Pires AR, Andreiuolo Fda M, de Souza SR. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology :14 doi: / Disponível em: com 123 casos de carcinoma infiltrante de mama (1 cilindro de 0,8 mm de diâmetro / 0,6 mm 2 ) e submetido à imuno-histoquímica (IHQ) com os anticorpos anti RE, RP, Her2/c-erbB2, citoqueratina 5 (CK5) e citoqueratina 34BE12 (CKAP). Todos os casos foram previamente submetidos a IHQ dos cortes inteiros com os anticorpos anti RE, RP, Her2/c-erbB2 e os resultados, comparados.

5 Técnica de construção do TMA, utilizando a técnica de Pires ARC e cols. Ref.: Pires AR, Andreiuolo Fda M, de Souza SR. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology :14 doi: / Disponível em:

6 Técnica de construção do TMA, utilizando a técnica de Pires ARC e cols. Ref.: Pires AR, Andreiuolo Fda M, de Souza SR. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology :14 doi: / Disponível em:

7 Técnica de construção do TMA, utilizando a técnica de Pires ARC e cols. Ref.: Pires AR, Andreiuolo Fda M, de Souza SR. TMA for all: a new method for the construction of tissue microarrays without recipient paraffin block using custom-built needles. Diagnostic Pathology :14 doi: / Disponível em:

8 Tecido 2 mm TMA Alternativo / TMA for all: sem bloco receptor pre-perfurado cilindros alinhados no mesmo plano parafina líquida permite fusionamente completo dos cilindros com o bloco de TMA microtomia convencional número de lâminas obtidas depende da espessura do corte Nível inicial lâmina 1 Nível intermediário lâmina 75 Nível profundo lâmina 150

9 Tecido 2 mm TMA Comercial bloco recipiente pré-perfurado cilindros não alinhados no mesmo plano, alguns podem ser inseridos muito profundamente parafinas diferentes dos cilindros e do bloco receptor podem não fundir adequadamente microtomia com fita adesiva necessária em alguns casos número de lâminas obtidas depende da espessura do corte e nível de inserção Nível inicial lâmina 1 Nível intermediário lâmina 75 Nível profundo lâmina 150

10 IHQ com os anticorpos: RE - Cell Marque, clone SP1 RP - Novocastra, clone 1A6 Her2-neu/c-erbB2 - Novocastra, clone CB11 CK 5 - Novocastra, clone XM26 CK AP - Cell Marque, clone 34bE12

11 Pontos de corte: RE e RP: qualquer célula com positividade nuclear Her2/c-erbB2: 2+ = mais de 10% das células com marcação completa fraca da membrana citoplasmática ou menos de 30% das células com marcação completa intensa da membrana citoplasmática 3+ = mais de 30% das células com marcação completa intensa da membrana citoplasmática CK5 e CKAP: mais de 10% das células neoplásicas com marcação citoplasmática, independente da intensidade

12 Classificações RE, RP e Her2/c-erbB2 = 4 tipos luminal A, luminal B, Her2+ e triplo negativo / basal Triplo negativo + citoqueratinas basais / de alto peso molecular (CK5, CK5/6, CK14, CK17, CK AP) = basal x não basal Tipo / Anticorpo RE RP Her2 Luminal A + +/- - Luminal B + +/- + Her Triplo negativo / basal Tipo / Anticorpo RE RP Her2 CK Luminal A + +/- - - Luminal B + +/- + - Her Triplo negativo / basal

13 Luminal A Luminal B Her2 + Basal

14 Resultados Classificação / anticorpo CK5 + CKAP + Luminal A, n= (71,9%) Luminal B, n= (86,6%) HER2, n=15 1 (6,6%) 12 (80%) Triplo negativo, n= (33,3%) 25 (83,3%) Sensibilidade 33,3% 92,6% Especificidade 98,8% 24,1% Valor preditivo positivo 90,9% 27,5% Valor preditivo negativo 81,1% 80,8%

15 Resultados Discordâncias entre TMA e cortes inteiros RE= 6,8%, RP= 8,6% e HER2/c-erbB2 = 1,7%, sempre com resultados negativos no TMA => amostragem Perdas Foram perdidos os mesmos 6 cilindros (4,9%) em todas as reações IHQ, demonstrando tratar-se de cilindros obtidos de blocos doadores com fragmentos teciduais remanescentes muito finos ou áreas puncionadas sem representação tumoral, e não por perda de aderência da lâmina. Houve ainda perda de 9 cilindros em reações isoladas (1,5%), provavelmente representando desgaste do material em níveis mais profundos de corte ou perda de aderência da lâmina de cilindros isolados

16 Discussão A definição do tipo basal tem sido alvo de diversos estudos e a maior parte inclui uma ou mais citoqueratinas basais (CK5, CK5/6, CK14 e CK17), além de p63, EGFR e p-caderina, entre outros. Apesar do paralelismo entre o padrão triplo negativo e o tipo basal, estes não são sinônimos. No nosso estudo não houve concordância total entre a definição do padrão triplo negativo e a identificação do tipo basal através das citoqueratinas, o que é freqüentemente observado na literatura. Utilizamos os anticorpos anti CK5 e CKAP (cone 34bE12, que reage com as citoqueratinas 1, 5, 10 e 14), com resultados divergentes. Provavelmente a maior sensibilidade e menor especificidade da CKAP são devidas ao maior número de citoqueratinas reconhecidas pelo clone 34bE12.

17 Conclusão A utilização desta técnica de construção alternativa de TMA, para estudos populacionais em carcinoma mamário, foi validada. A utilização de diferentes critérios para definir o subtipo basal levou a variação nas taxas de identificação. A utilização do anticorpo anti CK5 para identificação do tipo basal, associada ao perfil IHQ dos anticorpos anti RE, RP e HER2/c-erbB2, tem elevadas especificidade e valores preditivos, porém menor sensibilidade, sugerindo ganho na associação com outros marcadores de células basais, como a CKAP, que exibe elevada sensibilidade, porém baixos índices de especificidade e valores preditivos. São necessários mais estudos com correlação clínico-patológica para determinação da classificação IHQ mais relacionada com a evolução das pacientes.

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