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1 1 Universidade Estadual do Norte do Paraná UENP Formulário V do Edital Nº 004/ PIBIC/UENP RELATÓRIO DE BOLSA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA RELATÓRIO PARCIAL ( ) RELATÓRIO FINAL ( x ) 1. IDENTIFICAÇÃO: 1.1 Nome do bolsista: Natália Rocon de Oliveira 1.2 Nome do orientador/área de conhecimento: Fabio Rodrigues Ferreira Seiva/Ciências Biológicas 1.3 TítuLo do projeto: AVALIAÇÃO DA VARIABILIDADE E SIMILARIDADE ENTRE DOZE POPULAÇÕES DE Medicago sativa, DENOMINADAS DE CRIOULA COLETADAS NO MUNICÍPIO DE BANDEIRANTES-PR 1.4 Ano/curso do acadêmico: 5 ano de Agronomia 2 ATIVIDADES DESENVOLVIDAS: Foram utilizados DNAs, armazenados a -20ºC, de 12 populações de alfafa representada por 10 indivíduos cada. Os DNAs genômicos foram submetidos ao teste de integridade, em um gel de agarose a 1% por uma hora a 110 V. Os géis foram corados com brometo de etídio e fotodocumentados em máquina digital. A quantificação do DNA genômico foi realizada em espectrofotômetro UV na faixa de 260. O DNA puro foi diluído para uma concentração de trabalho de 10ng/µL. As populações foram avaliadas utilizando o marcador dominante RAPD (Random Amplification Polymorphic DNA), e para isso foi realizado um teste de primer avaliando os seguintes oligonucleotídeos: A1, A11, A17, A20, B1, B7, B10, B15, B16, B19, G2, G3, G7, G12, G13, G16, G18, G20, L17, L20, O3, O8, O20 e P5; os selecionados foram: A1, A11, B15, G3, G13, G16 e G18. O primer G13 foi aplicado em todas as populações utilizando 20 indivíduos por população e o mix utilizado é constituído por: 1X de tampão 10X, 4,0mM de MgCl; 0,2mM de dntp; 1U da Taq DNApolimerase, 0,4 um do primer e o volume final foi completado para 15 µl com água ultrapura. A programação para a amplificação foi de 5 minutos à 94 C; 45 ciclos de 94 C por 1 minuto, 37 C por 2 minutos e 72 C por 2 minutos; e um ciclo final de 5 minutos à 72 C. A corrida eletroforética foi realizada utilizando gel de agarose a 1,4% por 4 horas à 110V. O produto da amplificação foi corado com brometo de etídio e fotodocumentados em máquina digital. Após o término das aplicações com o primer G13, foram finalizados os trabalhos com a técnica RAPD pelo fato de que os primers foram pouco informativos quanto à diversidade genética das populações em estudo. Para a técnica microssatélite o DNA foi diluído para uma concentração de trabalho de 50ng/µL e foram testadas as seguintes diluições 50 ng/µl, 1/10, 1/100 e 25ng a partir da

2 2 concentração de 50 ng/µl, e as concentrações 5ng/µL, 1/10, 1/100 e 2,5ng, a partir da concentração de 5 ng/µl, para verificar quais as melhores concentrações para os seguintes primers de microssatélite(ssr): AFct32; AFca11 e MTLEC2A. As melhores diluições mostraram-se diferentes para os diferentes primers. até o momento foi aplicado o primer AFca11 em 10 indivíduos de cada população utilizando a diluição 1:10 da concentração de 5 ng/µl. Figura 1 Gel de poliacrilamida 8% contendo 3 populações de Medicago sativa com o marcador MITLEC2A e marcador 10pb. Coloração por nitrato de prata. A amplificação foi realizada utilizando 4,5 µl de GoTaq Green Master Mix, acrescido de 0,5µL do primer Foward a 2,5 um e 0,5µL do primer Reverse a 2,5 um; 2,5µL de água do Mix e 2 µl do DNA genômico. A programação para amplificação foi de 95 C por 5 minutos; 33 ciclos de 94 C por 45 segundos, 56,5 C por 45 segundos e 72 C por um minuto; e um ciclo final de 72 C por 10 minutos. Os géis foram corados com 100 ml de fixador ( 840 ml água destilada, 150 ml álcool absoluto e 10 ml ácido acético glacial) por 5 minutos, adicionando 1000 µl de nitrato de prata a 10% durante 3 minutos sob agitação constante, o gel foi lavado com água de torneira e adicionou-se 100 ml de revelador ( 30g NaOH e 1L água destilada) e 1000µL de formaldeído

3 3 agitando até visualizar os fragmentos do marcador e os produtos eletroforéticos, após esse processo, lava-se novamente o gel em água de torneira e adiciona-se 100 ml de fixador por 3 minutos. Os géis foram fotografados por máquina digital. O programa Atetra (Van Puyvelde, 2010) foi utilizado para obter a heterozigosidade média e a distancia genética entre as populações. O dendrograma de similaridade foi obtido com programa Famd (Schlüter 2013). Análises Genéticas Os perfis eletroforéticos obtidos foram analisados, determinando se cada individuo era homozigoto ou heterozigoto e quais alelos estavam presentes nestes indivíduos, considerando que M. Sativa é uma espécie autotetraplóide. O índice de heterozigosidade média apresentaram os valores 0,749; 0,505 e 0,735 para os marcadores Afca11, Afct32 e MITLEC2A respectivamente. A distância genética entre as populações com a menor distância foi entre a sete e nove (10,47) e a maior distancia genética foi entra a dois e oito (55,02). O dendrograma de similaridade apresentou oito agrupamentos, nas quais, as plantas das doze populações estão distribuídas aleatoriamente, inclusive para o cultivar denominado de crioulo melhorado no Rio Grande do Sul (Figura 2). Dois aspectos são fundamentais no planejamento de um programa de melhoramento genético: a seleção dos genitores e os mecanismos de herança dos caracteres a serem selecionados. Para a escolha dos genitores o conhecimento da variabilidade genética existente é decisivo (BARBOSA NETO, 1995) As análises preliminares demonstram que talvez todas as populações coletadas no município de Bandeirantes-PR, mesmo sendo cultivadas isoladamente durante muitos, sejam oriundas de uma mesma introdução realizada no passado, e que, a população melhorada geneticamente também venha da mesma base genética que as demais populações. Dentro de um programa de melhoramento genético, utilizando estas populações, seria melhor misturá-las para ter uma variabilidade maior ou utilizar a distância genética caso queira utilizar hibirdação.

4 4 Figura 2 Dendrograma de similaridade para as doze populações de Medicago sativa obtida pelo método de agrupamento UPGMA e coeficiente de Jacard. Referências Bibliográficas BARBOSA NETO, J.F. Application of molecular markers to genetic diversity and quantitative trait loci detection studies in oat and wheat. Ithaca, NY. 87p. Thesis (Plant Breeding) Cornell University, 1995 Schlüter, P. M. & Harris, S. A., Analysis of multilocus fingerprinting data sets containing missing data, Mol. Ecol. Notes: 6: Van Puyvelde, K. et al Molecular Ecology Res. 10: ADEQUAÇÕES/ALTERAÇÕES OCORRIDAS: A técnica do RAPD foi descartada pelo fato de que todos os primers analisados mostraram pouca diversidade genética entre as populações, portanto são pouco informativos. 4. DIFICULDADES ENCONTRADAS/CRÍTICAS OU SUGESTÕES: DESCREVER. Dificuldade de adquirir reagentes e materiais de consumo na atual estrutura da UENP. 5. PARECERES DO ORIENTADOR: 5.1 quanto ao desempenho do bolsista no projeto: O bolsista cumpriu as atividades determinadas com qualidade até o momento. Deveria dedicar mais tempo para leitura 5.2 quanto ao relatório do bolsista: Tem muita dificuldade quando se trata de redação científica, deveria ler mais e treinar mais este tipo de comunicação. O bolsista apresentou o que foi realizado no projeto de forma clara. Foi a contento 6. PARECER DO BOLSISTA QUANTO AO ORIENTADOR: Excelente orientação, sendo sempre disponível quando solicitado. 7. PARTICIPAÇÃO DO BOLSISTA EM DIVULGAÇÕES CIENTÍFICAS Não tem 8. INFORMAR O DESTINO DO BOLSISTA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA APÓS A

5 5 CONCLUSÃO DA ÁREA DE GRADUAÇÃO OU ATUAÇÃO COMO BOLSISTA: 8.1. Pós-Graduação: Especialização ( ) Mestrado( X ) Doutorado ( ) 8.2. Mercado de Trabalho: Público ( ) Privado ( ) 8.3. Outros (citar): 8.4. Sem atividade futura ( ) Data e assinaturas Bandeirantes, 14/08/2014 Assinatura do Acadêmico Assinatura do Orientador

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