BioDrop DUO Nota de Aplicação para dsdna

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1 BioDrop DUO Nota de Aplicação para dsdna Utilizando o espectrofotômetro BioDrop DUO para quantificar dsdna em amostras de microvolumes A quantificação de DNA em microvolumes é uma aplicação de rotina em muitos laboratórios de biosciências. Assim como a verificação de pureza de dsdna, é uma etapa chave antes da execução de experimentos como PCR, qpcr, sequenciamento de nova geração, imunoprecipitação de cromatina (ChIP) e imunoprecipitação de cromatina seguida de sequenciamento em larga escala (ChIP Seq). O sucesso de tais experimentos requer a quantificação exata e precisa do dsdna na amostra inicial. Além disso, o alto custo dos reagentes torna a exatidão da quantificação inicial ainda mais importante. Os cientistas também necessitam da flexibilidade para trabalhar com altas concentrações oferecida pela cubeta BioDrop 125, bem como volumes maiores utilizados em espectrofotometria. As opções atuais para quantificação direta de dsdna são espectrofotômetros convencionais ou instrumentos dedicados a microvolumes. A espectroscopia UV/Vis convencional exige a diluição da amostra, o que torna mais demorada a etapa de quantificação e aumenta a probabilidade de erros devido à manipulação da amostra. Os instrumentos para microvolumes existentes no mercado tem várias desvantagens, como possível variação do caminho óptico e baixa exatidão nos limites de detecção, bem como problemas com contaminação e formação de bolhas que interferem na análise. Para resolver esses problemas, a BioDrop desenvolveu um novo instrumento para microvolumes, o BioDrop DUO. O BioDrop DUO é um espectrofotômetro UV/Vis que tem uma plataforma de amostras exclusiva, com caminho óptico fixo de 0,5 mm, além de um compartimento para acomodar a cubeta BioDrop 125 ou cubetas convencionais de 10 mm. A plataforma de amostras simplifica a medição de amostras de DNA, RNA, oligonucletídeos e proteínas altamente concentradas ou em baixos volumes, enquanto que a opção de análise com a cubeta BioDrop dá aos cientistas a flexibilidade de quantificar amostras ainda mais concentradas. Devido ao fato do BioDrop DUO ter caminho caminho óptico fixo consegue-se excelentes resultados, dispensando totalmente a necessidade de calibração do caminho óptico. As concentrações são obtidas rapidamente utilizando o display touchscreen para selecionar métodos préprogramados no software interno. Importante ressaltar que os usuários não precisam perder tempo diluindo as amostras. Uma aplicação chave de medição direta de microvolumes é a quantificação de dsdna. Para demonstrar a performance do BioDrop DUO, foi realizada uma série de experimentos visando determinar o volume mínimo de amostra, limites de detecção, reprodutibilidade, linearidade e contaminação entre amostras. Tabela 1. Resumo dos Resultados Plataforma de amostras Cubeta BioDrop 125 Limite de Detecção de DNA (ng/µl) 1,0 7,1 Volume Mínimo (µl) 0,5 0,6 Concentração Máxima (ng/µl) Caminho Óptico (mm) 0,5 0,125

2 Materiais e Métodos Espectrofotometria UV/Vis - BioDrop DUO O BioDrop DUO é um espectrofotômetro UV/Vis de feixe dividido (split-beam), que utiliza uma lâmpada de Xenônio e um detector CCD de 1024 elementos. Essa tecnologia entrega resultados rápidos e de alta qualidade. Detalhes das especificações técnicas podem ser vistos na Tabela 2. O BioDrop DUO gera resultados rápidos: não é necessário tempo para aquecimento e o instrumento é prontamente controlado por um display touchscreen colorido de alta resolução. As amostras são pipetadas diretamente na plataforma ou na cubeta para serem, então, avaliadas. Materiais e Métodos O dsdna purificado de esperma de salmão (Sigma- Aldrich ref. D MG) foi ressuspendido diretamente em água HyPure Molecular Biology Grade (GE Healthcare) antes da quantificação utilizando o espectrofotômetro BioDrop DUO. O caminho óptico de 0,5 mm foi selecionado no menu do software interno, para medições utilizando a plataforma de amostras do BioDrop DUO. Alternativamente, o caminho óptico de 0,125 mm foi selecionado para análise utilizando a cubeta BioDrop 125. As concentrações de DNA foram calculadas automaticamente utilizando o método pré-programado para quantificação de DNA: a absorbância é medida em uma varredura de 230 a 320 nm. A concentração de dsdna foi determinada subtraindo a absorbância em 320 nm da absorbância em 260 nm e, então, multiplicando a absorbância corrigida pelo fator de concentração de DNA (50 µg/ml) e pelo fator de normalização do caminho óptico (20, no caso da plataforma e 80, no caso da cubeta BioDrop 125). Múltiplos instrumentos foram testados para determinar limites de detecção, volume mínimo de amostra, linearidade, reprodutibilidade e contaminação entre amostras. Dados representativos do grupo-teste são apresentados nas Figuras 1 a 3. Os limites de detecção foram determinados realizando uma série de vinte medições na plataforma de amostras, utilizando o método para DNA pré-programado no software interno. Tabela 2. Especificações Técnicas Display Touchscreen capacitivo colorido de 5,7 Fonte de luz Lâmpada pulsada de Xenônio com 3 anos de garantia Detector garantia CCD com 1024 elementos Faixa de Comprimentos de Onda Exatidão do Caminho Óptico Exatidão do Comprimento de Onda Reprodutibilidade do Comprimento de Onda Largura de Banda Espectral Luz Espúria Plataforma de amostras tem exatidão de ±5 µm ±2 nm nda ±1 nm 5 nm <0,5%T em 220 nm e 340 nm utilizando NaNO 2 Faixa de Absorbância -0,3A a 2,5A, 0 a 199%T Exatidão da Absorbância Reprodutibilidade da Absorbância Ruído Saída de Dados Energia Dimensões Peso Software Life Science para PC Idiomas do Software Interno 190 a 1100 nm ±0,005A ou 1% da leitura, o que for maior em 546 nm ância ±0,003A (0 a 0,5A), ±0,007A (0,5 a 1,0A) 0,005A pico a pico, 0,002A RMS Saída USB para pendrive e saída USB para PC 90 a 250V, 50/60 Hz, Máx. 30VA 420 x 260 x 185 mm Aprox. 3 kg DNA, RNA, oligo, eficiência de marcação com sondas, cálculo de Tm, métodos colorimétricos e UV direto para proteínas, densidade celular Inglês, Francês, Alemão, Espanhol e Chinês Simplificado O volume mínimo de amostra foi avaliado realizando uma série de medições com uma microseringa de 1 µl. A reprodutibilidade da medição em volumes decrescentes foi determinada pelo cálculo da média e desvio padrão. A linearidade do instrumento foi determinada plotando a concentração medida em relação à diluição da amostra. Por fim, a contaminação entre amostras foi avaliada alternando medições de água e soluções de dsdna. A plataforma de amostras foi simplesmente seca com lenços que não soltam fiapos (tipo KimWipes ou similares) entre as medições para avaliar a eficácia da limpeza entre as amostras.

3 Resultados Linearidade das Medições do BioDrop DUO Foram avaliadas amostras em uma faixa de concentrações de DNA. A concentração de cada amostra foi medida cinco vezes. Foi calculada a média para cada concentração e, então, plotada em função do fator de diluição. O BioDrop DUO apresentou excelente linearidade até 2500 ng/µl, como pode ser observado pelo valor de R 2 =0,9998 na Figura 1. O valor de R 2 se refere à exatidão das medições em uma linha, na qual medições apresentando boa linearidade tem valor de R 2 entre 0,9 e 1,0. Fator de Diluição 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 Linearidade da Plataforma de Amostras R² = 0,9998 Figura 1: A linearidade da plataforma de amostras foi determinada plotando as concentrações em função dos respectivos fatores de diluição. Linearidade da Cubeta BioDrop 125 A linearidade da cubeta BioDrop 125 também foi avaliada no BioDrop DUO. As concentrações medidas foram plotadas em função dos fatores de diluição. Foi obtida uma excelente linearidade, como demonstrado pelo valor de R 2 =0,9997. Fator de Diluição 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 R² = 0, Figura 2: A linearidade da cubeta BioDrop 125 foi determinada plotando as concentrações em função dos fatores de diluição. Limite de Detecção de dsdna da Plataforma de Amostras O limite de detecção de dsdna da plataforma de amostras do BioDrop DUO é uma especificações importante, que informa o usuário da concentração mínima que pode ser medida. Um baixo limite de detecção permite que os usuários utilizem o volume mínimo de amostra nas medições, deixando maior quantidade de amostra disponível para experimentos subsequentes. O limite de detecção da plataforma de amostras foi repetidas vezes menor que 1 ng/µl, a melhor especificação da categoria, como pode ser visto na Figura 3. O limite de detecção ao utilizar a cubeta BioDrop 125 foi de 7 ng/µl. Limite de Detecção de dsdna da oplataforma f t he In -B de uilt Amostras S C 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 Plataforma 1 Plataforma 2 Plataforma 3 Figura 3: Análise do limite de detecção de três plataformas de amostras.

4 Reprodutibilidade e Contaminação Mínima Entre Amostras Foram feitas medições para determinar se há contaminação entre amostras subsequentes. Uma simples secagem com lenço que não solta fiapos é suficiente para reduzir a contaminação entre amostras a valores não detectáveis, como demonstrado na Figura 4. A cubeta BioDrop 125 foi avaliada quanto à contaminação entre amostras na Figura Reprodutibilidade e Contaminação da Plataforma de Amostras 0 Água DNA Água DNA Água Wat DNA Figura 4: A contaminação com DNA foi analisada medindo concentrações de amostras (na plataforma de amostras), seguidas imediatamente por amostras de água. Reprodutibilidade e Contaminação da Cubeta BioDrop Água DNA Água DNA Água DNA DNA Wat Figura 5: A contaminação com DNA foi analisada medindo concentrações de amostras (na cubeta BioDrop 125), seguidas imediatamente por amostras de água. Volume Mínimo de Amostra Volume Mínimo na Plataforma de Amostras Outro parâmetro chave para quantificação de microvolumes de dsdna é o volume mínimo que pode ser pipetado e mensurado para se conseguir resultados reprodutíveis e exatos. Para tanto, foi utilizada uma microseringa de 1 µl para pipetar dsdna em volumes decrescentes. A Figura 6 mostra que o volume mínimo que pode ser pipetado na plataforma de amostras é de 0,5 µl, mantendo excelente desempenho nas medições ,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Volume (µl) Figura 6: Foram efetuadas medições de volume mínimo <1 µl para avaliar a reprodutibilidade em baixos volumes.

5 Métodos que Requerem Medições de Microvolumes A Tabela 3 destaca as principais aplicações pósquantificação. Estes ensaios requerem amostras em altas concentrações e baixos volumes. Tabela 3. Principais Ensaios em Biologia Molecular que Requerem Quantificação de DNA Sequenciamento 125 ng / 20 µl (6ng / µl) Sequenciamento de Nova Geração 10 ng / µl Transfecções Vacinas de DNA* 5-30 µg /100 µl (50-300ng / µl) 0,5-2 mg PCR 2ng / µl qpcr 200ng/100µl (2 ng / µl) Microarranjos de DNA > 2 µg sirna 7,5 µg / µl Captura de Conformação Cromossômica 2-3 ng / µl Cristalografia de proteínas 50 ng / µl * Utilizando cubeta BioDrop 125. Software BioDrop Resolution O BioDrop Resolution Life Science é um software poderoso e intuitivo para PC que acompanha o BioDrop DUO. O software BioDrop Resolution Life Science permite medições rápidas e eficientes, bem como análise dos resultados. O software contém métodos para análise de DNA, RNA, oligonucletídeos e proteínas, entre outros. A Tabela 4 resume as principais características do software BioDrop Resolution. A BioDrop também fornece um módulo CFR (opcional), para laboratórios que necessitam estar em conformidade total com a parte 11 do Título 21 do Código de Regulamentos Federais dos EUA (21 CFR part 11). Métodos Life Science Desenvolvedor de Métodos Leitura Rápida Varredura Rápida Análise de Cy dye Tabela 4. Software BioDrop Resolution Medidas de concentração e pureza de DNA, RNA, oligonucleotídeos e proteínas, entre outros. Desenvolva seu próprio protocolo de experimentos. Customize a análise para atender às suas necessidades. Meça a absorbância de amostras desconhecidas antes de experimentos adicionais. Faça uma varredura de comprimentos de onda de amostras de absorbância desconhecida para confirmar picos de absorção. Medições de abosrbância para verificar a eficiência de marcação de amostras de DNA e/ou proteínas.

6 Software Interno O BioDrop DUO pode ser controlado por meio do display touchscreen colorido para análise independente de PC. O software interno é intuitivo, fácil de navegar e fornece análises quantitativas e qualitativas dos dados, tornando as medições e análises simples e eficientes. O método para análise de DNA utiliza uma varredura de comprimentos de onda para quantificar e avaliar pureza. São apresentadas quatro medidas de absorbância: 1. A230nm - Pico de absorbância de possíveis contaminantes da etapa de preparo da amostra, como fenol e clorofórmio, entre outros. 2. A260nm - Pico de absorbância do DNA. 3. A280nm - Pico de absorbância de proteínas. 4. A320nm - Utilizado como correção de fundo. Conclusão O BioDrop DUO é um instrumento dedicado a microvolumes que representa um nítido avanço em relação aos instrumentos existentes. Sem o uso de partes móveis, o BioDrop DUO possui uma plataforma de amostras exclusiva, que apresenta limite de detecção de dsdna de 1 ng/µl. Pode-se atingir a concentração máxima de ng/µl de dsdna. Utilizando a cubeta BioDrop 125 no BioDrop DUO, a faixa de medição é extendida a até ng/µl, com o uso de apenas 0,6 µl de amostra. A plataforma de amostras é fácil de utilizar e podem ser pipetados e medidos com exatidão volumes tão baixos quanto 0,5 µl. Importante ressaltar que a plataforma é fácil de limpar, prevenindo assim contaminação entre amostras. Em suma, o BioDrop DUO é intuitivo, fácil de usar e possui especificações excelentes, além de poderosos recursos. O BioDrop DUO representa um novo padrão de excelência na medição de microvolumes e você nunca irá precisar calibrá-lo. BioDrop Tel: +44 (0) enquiries@biodrop.co.uk Web: