Uso de Scanalyzer com embriões de Danio rerio

Transcrição

1 Uso de Scanalyzer com embriões de Danio rerio Background histórico e biológico Quando se iniciou o movimento de proteger o ambiente através de sistemas de testes biológicos, os testes agudos e crônicos foram os primeiros a ser introduzidos. Em muitos paises e em diversas normas internacionais, os ensaios com peixes têm um papel importante para verificar a toxicidade de substancias ou amostras ambientais. Apesar da experiência de sucesso de longos anos com estes testes, recentemente foi possível observar o seguinte: 1. Grandes reduções na toxicidade em efluentes resultam cada vez mais em testes de rotina sem encontrar toxicidade nos níveis de diluição definidos. 2. Crescente preocupação com proteção de animais levando à tentativa de reduzir os testes com peixe, especialmente em casos onde os resultados são negativos. 3. Progresso científico e estudos de validação resultaram numa boa correlação entre testes agudos com peixes e testes especialmente projetados com peixe zebra. 4. Ampla pesquisa com o modelo peixe zebra nos campos da genética e da biología evolucionaria revelaram que uma grande quantidade de sintomas e efeitos pode ser determinada com estes testes. 5. Novas regulamentações internacionais para fornecer mais informações sobre toxicidade ambiental de uma quantia crescente de substancias criou a necessidade de testes biológicos de baixo custo para poderem ser executados em grande quantidade. Baseado nestas considerações iniciou-se uma padronização do teste de 48 h com embriões de Danio rerio partindo de princípios diferentes. Padronização Para substituir o teste com peixes como usado na Alemanha para controle de efluentes foi desenvolvido um ensaio de 48 horas com ovos de peixe zebra, posteriormente validado e padronizado como norma DIN Este teste faz agora parte da regulamentação Alemã para efluentes e é usado para definir a multa que o poluidor deve pagar. Baseado nesta norma DIN um desenvolvimento adicional migrou para o nível ISO com o propósito de desenvolver uma norma que seja adequada para teste de amostras ambientais, efluentes e produtos químicos puros também. Conjuntos de dados sendo montados agora irão mostrar até onde existe correlação entre testes com peixes e testes com embriões. Os primeiros ros resultados mostraram que as diferenças entre as

2 diferentes espécies de peixes sendo usados podem ser maiores que diferenças entre uso de peixes ou embriões. Por este motivo a padronização do ensaio com embriões de peixe será um passo importante para reprodutibilidade e comparabilidade dos resultados de teste. Existem esforços paralelos na OECD de desenvolver um texto guia para ensaio de teste com embriões de peixe. Como usual com guias OECD o texto permitirá uma maior variabilidade nos parâmetros de observação a serem usados para avaliação da toxicidade. Pesquisa básica tem mostrado que ensaios com embriões de peixe podem servir como modelo muito eficaz para avaliar efeitos de uma serie ampla de substancias em vertebrados. Desenvolvimento rápido e transparência uma vantagem e desafio ao mesmo tempo As vantagens principais do teste, o completo desenvolvimento do embrião em 48 horas e opção de poder observar todos os passos do desenvolvimento graças à transparência, são realmente vantagens muito interessantes, mas ao mesmo tempo representam desafios. A necessidade de trabalhar em regime acelerada em tempo integral de 48 horas é a maior restrição para documentar um estudo compreensivo. Execução do teste com o Scanalyzer HTS da Lemnatec O Scanalyzer HTS da Lemnatec pode atender as demandas do teste facilmente. O teste é executado com amostras dentro de poços de uma microplaca e a câmera móvel do Scanalyzer observa continuamente o desenvolvimento dos embriões durante toda a duração do ensaio. Dependente do tempo para fertilização, é possível adquirir imagens singelas para obter informação sobre o desenvolvimento estrutural. Mais tarde quando a mobilidade se torna a ser mais e mais importante, adquire-se também series temporizados de imagens para quantificar o movimento do embrião. Baseado no processamento de imagens no background uma grande quantidade de dados relacionados a tempo estará disponível no final do teste. Através de ajustes do sistema de controle em qual podem também ser especificados desvios interessantes, o Lemnatec Hit Finder irá realçar os respectivos poços para permitir uma posterior análise pelo pesquisador. Isto permite de fazer uma análise rápida no final do teste mesmo que este contém alto numero de amostras individuais. Aquisição das imagens Imagens foram adquiridas em placas de 24 poços com fundo redondo, microplacas de 96 poços de fundo redondo e microplacas com poços cônicos. É necessário usar poços com fundo redondo ou cônico para manter os ovos no centro da imagem. Isto permite maior ampliação e diminui o efeito de menisco. Dependendo da tensão e o volume da solução o menisco pode influenciar a imagem em placas de 96 poços enquanto este efeito é completamente eliminado em placas de 24 poços. Usando volumes maiores se aproxima mais das normas internacionais existentes e parece permitir melhor crescimento do embrião.

3 Processamento das imagens As seguintes imagens podem fornecer uma primeira visão das opções de analisar os diferentes estágios do desenvolvimento automaticamente. É muito interessante que os ovos do Danio rerio são transparentes por natureza. Isto permite observação não-destrutiva em qualquer estágio do desenvolvimento. Num primeiro passo o embrião será separado do integumento do ovo através de processamento de imagem. Num segundo passo o ovo será analisado em detalhes baseado em tamanho e cor de diferentes estruturas, permitindo classificação do estágio de crescimento.

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5 Imagens originais e imagens analisadas pelo analisador Scanalyzer HTS. Os resultados são quantificados baseados em formato, cor e tamanho de objetos.

6 Finalmente este processo leva à classificação dos estágios de crescimento. Uma vez que ovos e especialmente larvas em movimento nem sempre mostram o lado mais significativa em todas as imagens, a aquisição repetitiva de imagens ao longo do tempo permite a melhor caracterização dos estágios de crescimento, incluindo verificações de consistência. Os resultados de análise de imagens serão verificados de forma cruzada com tempo após a fertilização para definir desvios de desenvolvimento normal. Análise de movimento Durante estágios intermediários de crescimento informação sobre o movimento do embrião é muito importante, mas difícil de quantificar sem um processamento de imagem. Esta informação fornece uma avaliação muito integral do desenvolvimento muscular e neural. Os seguintes gráficos mostram a atividade do embrião observada durante períodos de 24 segundos e 100 segundos cada vez num estágio inicial e posterior do desenvolvimento. Em ambos os casos foram adquiridas 50 imagens durante o período de observação. Foi adicionado nicotina aproximadamente 5 segundos antes da primeira observação nic 1. Atividade é definida como movimento significativo na posição dentro de 0,5 segundos. Teste 1 com nicotina Estágio precoce de desenvolvimento Fases de atividade de embrião de peixe durante diferentes períodos de observação (Ref 1-3 e Nic 1-7), antes e depois da adição de uma dose de nicotina no tempo 0 minutos. Naquela instancia o embrião tinha uma idade de 26 horas.

7 Atividade acumulada durante períodos de 25 segundos ao longo do tempo medida nos pontos (datapoints) mostrados. s. Teste 2 com nicotina Estágio em fase posterior de desenvolvimento

8 Fases de atividade de embrião de peixe durante diferentes períodos de observação (Ref 1-3 e Nic 1-7), antes e depois da adição de uma dose de nicotina no tempo 0 minuto. Naquela instancia o embrião tinha uma idade de 50 horas. Atividade acumulada durante períodos de 100 segundos ao longo do tempo medida nos pontos (datapoints) mostrados. Os resultados mostram em ambos os casos nitidamente a reprodutibilidade das medições de referências e a capacidade de avaliar movimento maior ou menor em relação aos valores de controle. Informações adicionais como duração de atividade, quantidade de fases de atividade por unidade de tempo ou intensidade de atividade podem ser extraídas das curvas de atividade ou de processamento mais detalhado das imagens. Detecção de batimento cardíaco Perto do fim do teste os embriões reduzem o movimento geral e o batimento cardíaco se torna um importante parâmetro de observação. Graças à alta transparência o batimento cardíaco é visível em muitas posições do embrião. Como as observações são repetidas diversas vezes, a existência de batimento cardíaco é um excelente parâmetro de observação. A imagem seguinte mostra em vermelho os principais centros de atividade cardíaca encontrados pelo processamento de imagem após um período de observação de 3 segundos.

9 Conclusão Final O uso do Scanalyzer HTS possibilita uma análise compreensiva do teste com embriões de Danio rerio e fornece uma densidade de dados excedendo em muito a observação manual. Novos parâmetros tais como intensidade de movimento, podem ser avaliados. A combinação de um sistema de teste rápido com captura automática de dados e subseqüente análise permite fazer caracterização quantitativa de todas as fases de crescimento para detectar alterações no tempo de desenvolvimento e qualidade, mesmo durante períodos fora de horas normais de trabalho.