Cálculo de potência; Limites de confiança; Análise estatística (ANOVA).

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1 CENTRO UNIVERSITÁRIO FRANCISCANO UNIFRA CURSO DE FARMÁCIA CONTROLE BIOLÓGICO DA QUALIDADE DE MEDICAMENTOS DELINEAMENTO: 3 x 3 3 doses do padrão Prof. Marcos R. dos Santos P2 A1 A3 A2 P1 A = amostra P= padrão 3 doses da amostra 1 ensaio = 6 placas Cálculo de potência; Limites de confiança; Análise estatística (ANOVA). 24,25 S 3 T 1 18,04 18,24 S 1 S 2 21,43 X 6 21,45 T 2 T 3 24,32 Razão= 2 1

2 CÁLCULO DE POTÊNCIA POTÊNCIA= antilog M x Verificar valor indicado na monografia da Farmacopéia Brasileira; - Estipular limites de confiança. ANOVA VALIDADE ESTATÍSTICA - A diferença entre preparações não for significativa; - Regressão for significativa; - O desvio de paralelismo não for significativo; - O desvio de linearidade não for significativo; - Entre doses for significativo; - Entre placas não for significativo. Cada placa com 2 doses alternadas: a CONCENTRAÇÃO DE REFERÊNCIA (CR) e a outra é uma das 4 concentrações do padrão ou dose da amostra P1 P1 P1 P2 P2 P2 A A A P4 P4 P4 P5 P5 P5 - Cada placa inclui duas doses, em posição alternada: concentração de referência (concentração central da curva padrão) e uma das quatro concentrações do padrão ou a dose da amostra de potência desconhecida; - Mais preciso e mais exato que o ensaio 2 x 2 e o 3 x 3; - Não é um ensaio de retas paralelas, formando somente uma curva padrão; - Farmacopéia Americana. A = amostra P= padrão 2

3 Incubar as placas na temperatura indicada (± 0,5 C) na Tabela I e as - Realizar o ensaio em triplicata: 15 placas; - Cada placa não se constitui em um ensaio particular, ocasionando a necessidade de um sistema de correção entre placas; - As respostas corrigidas serão empregadas para a construção da curva padrão e cálculos subseqüentes, após a interpolação corrigida das amostras; - Construção do gráfico em papel monolog: 5 pontos ou 2 pontos (calculado) para determinação da potência. monografias específicas da F. Bras. 5 edição, durante 1 6 a 18 horas. Para alguns MO s pode-se melhorar o procedimento se as placas preparadas permanecerem de 30 min. a 2 horas em temperatura ambiente. Empregar paquímetro, régua milimetrada ou projetor óptico para medir o diâmetro dos halos de inibição. Cálculo da potência A partir dos resultados, calcular a potência da amostra e seus limites de confiança, por meio de método estatístico padrão descrito em Procedimentos estatísticos aplicáveis aos ensaios biológicos - ensaios indiretos quantitativos (8.5). PLANEJAMENTO DO ENSAIO 5X1 Padrão na concentração de 0,64 mcg/ml PLANEJAMENTO DO ENSAIO 5X1 Padrão na concentração de 0,80 mcg/ml 17,96 20,76 19,39 21,14 18,86 20,99 18,97 20,48 21,38 19,29 20,72 19,34 20,62 19,71 20,63 19,64 17,72 20,24 19,15 21,48 18,91 21,13 19,79 20,92 19,39 21,82 19,65 20,73 21,23 19,35 21,02 18,91 19,28 21,16 20,26 20,77 3

4 PLANEJAMENTO DO ENSAIO 5X1 Padrão na concentração de 1,25 mcg/ml PLANEJAMENTO DO ENSAIO 5X1 Padrão na concentração de 1,56 mcg/ml 22,55 20,60 21,51 20,50 23,58 21,04 23,39 20,42 21,13 21,46 20,82 21,40 21,66 23,54 21,45 23,21 21,47 20,64 21,70 20,95 23,39 21,31 23,78 21,14 21,35 20,70 23,79 21,94 20,92 21,49 21,29 23,25 21,32 20,24 23,65 21,87 PLANEJAMENTO DO ENSAIO 5X1 Padrão na concentração de 1 mcg/ml 21,28 21,32 21,34 21,23 21,06 21,00 21,23 21,20 21,28 21,20 21,46 21,15 (c) (a) 16,84 (b) 19,55 (d) (e) 20,24 24 (e) 18,08 18,38 = -0,30 16,32 0,30 = 16,02 18,08 18,23 = -0,15 16,99 0,15 = 16,84 Potência da amostra: 21,26 21,35 21,14 21,03 21,28 21,10 17,86 17,86 = (f) (g) +0,22 0,22 17,7 = (h) Gráfico da curva padrão em papel monolog: Abscissas: média corrigida dos halos do padrão (escala aritmética) Ordenada: concentração do padrão (escala logarítmica) Ou determinar a equação da reta e o coef. de correlação 4

5 Ou aplicar equações que conduzam ao cálculo de 2 pontos através dos quais é traçada a reta: Onde: 1, % 0, x% X= 95% L = 3a + 2b + c e 5 H = 3e + 2d + c a 5 L= resposta calculada (halo) para a conc. mais baixa da curva H = resposta calculada (halo) para a concentração mais alta da curva C = média aritmética das 36 das 36 leituras da conc. de referência (ex: 18,08) a, b, d, e = valores corrigidos dos outros pontos da curva, sendo a a conc. mais baixa e e a conc. mais alta. Exemplo: SQR 18 mm 18 mm % ( 1mcg/ml) 17,92 mm x % X% = 99,55 % E = [ (2 x e) + d b (2 x a) ] / (10 x 9) F = (g - f) / 9 I = log do fator geométrico da escala de doses b = E / I M = F / b Potência = R = antilog M x 100 5

6 Avaliação da penicilinase Doseamento de fatores de crescimento Vitaminas e aminoácidos: - Mesmas orientações e princípios para os antibióticos, porém difere quanto à atividade biológica. - O desenvolvimento do microrganismo teste deve apresentar dependência total em relação à substância teste. Zona ou halo de exibição de crescimento - Inoculação do MO sensível à penicilina em ágar contendo este antibiótico. - Soluções-teste e padrão de penicilinase em diferentes concentrações, seguindo os delineamentos preconizados para os antibióticos, são depositados sobre o meio inoculado Zona ou halo de exibição de crescimento Inocular o meio de cultura recomendado para o ensaio com quantidade conhecida de microrganismo sensível ao antibiótico. Após aproximadamente 4 horas de incubação, a turbidez bacteriana deve ser de fácil medida e mantenha a correlação: Uso da Tabela 3: - MO s - Meio de cutura; DOSE x CONCENTRAÇÃO - Volume de inóculo padronizado sugerido como referência inicial - Temperatura de incubação para cada caso Considera a relação entre a proporção de crescimento de população microbiana no meio líquido e a concentração da substância. - Rapidez: emprego do meio líquido; - Facilidade operacional; - Medida objetiva da resposta. - Necessidade de equipamento para leitura da resposta; - Coloração da amostra que interfira na leitura fotométrica. 6

7 Farmacopéia Brasileira, 5ª edição pág-267 Na Tabela 1 estão descritos os antibióticos a serem analisados pelo método turbidimétrico com descrição geral do ensaio. Na Tabela 2, há indicação, para cada antibiótico, da preparação da solução padrão de trabalho e da curva padrão Empregar pelo menos 3 doses, com doses em progressão geométrica da amostra em concentrações presumidamente similares à substância padrão de potência conhecida, conforme monografia. Ex: 0,64; 1,0 e 1,56 UI/ml. Determinar experimentalmente o volume de inóculo a ser adicionado a 100 ml de caldo a partir da quantidade sugerida como referência inicial (Tabela 1). O meio inoculado deve ser preparado e utilizado imediatamente. 7

8 Preparação da solução de trabalho, da amostra e da curva padrão Procedimento para delineamento retas paralelas (3 x 3 ou 2 x 2) Procedimento para delineamento curva 5 x 1 Cálculo da potência Intervalo de confiança (IC) PROCEDIMENTO (Exemplo de delineamento 3 x 3) - Distribuir em volumes iguais de cada uma das soluções do padrão e da amostra em caldo nutriente inoculado. 1 ml sol. amostra (A1, A2 e A3) ou padrão (P1, P2 e ) + 9 ml de meio - Três tubos para cada concentração do padrão e amostra: 3 x 3 (18 tubos); - Incubar em banho-maria, à temperatura adequada, por 3 a 4 horas, tomando precauções de manter a temperatura uniforme durante todo ensaio. - Após o período de incubação, interromper a multiplicação dos Mo s pela adição de 0,5 ml de solução de formaldeído 12%; - Determinar a absorbância para cada tubo em fotocolorímetro apropriado, no comprimento de onda de 530 nm; Cálculo da potência A partir dos resultados, calcular a potência da amostra e seus limites de confiança, por meio de método estatístico padrão descrito em Procedimentos estatísticos aplicáveis aos ensaios biológicos - ensaios indiretos quantitativos (8.5). A potência de alguns antibióticos, vitaminas, produtos endócrinos e biológicos (ex. vacinas) é baseada em sua atividade biológica demonstrada. Quando os agentes correspondem aos critérios internacionais estabelecidos de potência, são definidos pelo termo unidades internacionais (UI). Em algumas situações, a atividade biológica é definida em termos de massa, como microgramas (de agente ativo) por miligrama, ou por outros termos e padrões de medida. Exemplo: Penicilina G sódica estéril especifica a potência de não menos do que 1500 e não mais do que 1750 unidades por miligrama. Exemplo: Ampicilina sódica apresenta potência equivalente de 845 a 988 µg/mg de seu composto de origem, a ampicilina. 8

9 1- Preparar 50 ml de uma solução, com concentração aproximada de 2000 UI/ml, a partir de uma suspensão oral de 60 ml do antibiótico X, contendo UI. 2- O produto biotecnológico interferon beta-1b contém 32 milhões de UI por miligrama. Calcule o número de unidades internacionais presentes em um frasco contendo 0,3 mg de interferon beta-1b. 3- Calcule a potência equivalente de clindamicina base, em miligramas por mililitro, de uma solução contendo 1grama de Cloridrato de clindamicina em 10 ml de solução. Informação: Cada mg de Cloridrato de Clindamicina equivale a 800 µg de clindamicina base. 4- Quantas soluções da substância utilizada como padrão de referência, devem ser preparadas para serem aplicadas nos delineamentos: 2x2; 3x3 e 5x1? a) 2; 1; 3. b) 5; 3; 1. c) 2; 3; 1. d) 2; 3; Qual a razão e as concentrações das soluções amostra utilizada neste exemplo de ensaio 3 x 3? Informações: S1:? S2: 1µ/ml S3: 2 µ/ml. T1:? T2:? T3:? 6- Calcule a potência da amostra. ( M = - 0,00345) Potência = antilog M x Calcular a potência da amostra, através dos resultados obtidos no ensaio de potência de antibióticos com delineamento 3x3: 9

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