Biologia Molecular. Caderno de relatórios. Turma 3 Grupo 2 Alexandra Teixeira, Catarina Cunha, Mª Inês Silva. Licenciatura em Bioquímica 2013/2014

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1 Biologia Molecular Caderno de relatórios Turma 3 Grupo 2 Alexandra Teixeira, Catarina Cunha, Mª Inês Silva Docentes: Dr. Cláudio Sunkel, Prof. Mariana Osswald 1

2 Extração de DNA genómico de Drosophila Melanogaster Objetivos Purificação de DNA genómico de Drosophila melagnoster; avaliação dos efeitos da ação de tratamentos físicos distintos na integridade do DNA isolado. Alterações ao procedimento experimental Durante o isolamento do DNA foi suprimido o passo da sua lavagem ( adicionar ao DNA precipitado 500 l de uma solução de lavagem de etanol 70% (frio) e centrifugar a rpm durante 2 minutos a 4 o C ). Na análise espectrofotométrica, foram colocados na cuvette 690 l de água ultra-pura e 10 l da amostra de DNA (resultando numa diluição a 70x e não 140x como descrito no procedimento). No estudo da ação dos diferentes tratamentos físicos na integridade do DNA genómico, foram colocados em todos os tubos eppendorf 9 l da amostra de gdna, em vez de 10 l. O tubo sujeito a aquecimento a 95 o C sofreu este processo durante 5 minutos (e não 10). g/ml) -1 cm -1 l = 1 cm Abs = ε c l = 0.02 * 1 * c c = 5.2 g/ml Antes da diluição a 70x : c = 5.2 * 70 = 364 g/ml Concentração de DNA na amostra Cálculo dos pesos moleculares das amostras Resultados experimentais Determinação da concentração e grau de pureza do DNA por espectrofotometria Abs 260 nm = Abs 280 nm = Abs 260 nm Abs 280 nm = 1.70 Grau de pureza da amostra Figura 1 Eletroforese em gel de agarose. Marcador de pares de bases (1); gdna (DNA genómico) (2); gdna vortexado intensamente (3); gdna aquecido a 95ºC (4); gdna pipetado múltiplas vezes (5); os poços de (6) a (10) são referentes aos trabalhos Extração de DNA plasmídico de Escherichia coli e Análise eletroforética de DNA digerido com enzimas de restrição. 2

3 Log (PM) Licenciatura em Bioquímica Tabela 1 Valores referentes aos pesos moleculares do marcador, à distância migrada de cada banda e ao logaritmo dos pesos moleculares. PM / pb d migrada /cm log (PM) A partir da regressão linear do logaritmo dos pesos moleculares (log PM) em função da distância migrada (d) obtém-se a seguinte equação: log (PM) = d r 2 = log(pm) = d R² = Distância migrada / cm Gráfico 1 Representação gráfica da distância migrada pelos marcadores de peso molecular em função do logaritmo do seu peso molecular e respetiva regressão linear. Tabela 2 Distâncias migradas por cada banda dos poços 2 a 5 e respetivo peso molecular obtido a partir da reta supra-referida. Poço Distância migrada/cm Peso molecular /Pb Não se observam bandas neste poço Discussão dos resultados/ Conclusão Devido às ligações duplas das bases azotadas, o DNA absorve radiação ultravioleta a 260 nm (tal como certos tipos de RNA). Deste modo, o método espectrofotométrico pode ser usado com alguma fiabilidade na determinação da concentração de DNA numa amostra. A concentração obtida foi de 364 g/ml. É de relevância determinar-se o grau de pureza da amostra, dado pela divisão entre a absorvância a 260 nm (proporcional à quantidade de DNA) e a absorvância a 280 nm (proporcional à quantidade de fenol e proteínas, cujos resíduos aromáticos são responsáveis pela absorção). Obteve-se um grau de pureza de 1.70, concluindo-se que a amostra se encontrava, possivelmente, contaminada com proteínas e fenol (valor inferior a 1.8; seria pura caso o grau de pureza estivesse contido entre 1.8 e 2.2). Uma alternativa a este método seria a utilização da fluorescência: o brometo de etídeo intercalado entre as bases da cadeia dos ácidos nucleicos emite fluorescência (cuja intensidade é proporcional à massa total de DNA), que quando comparada com uma série de padrões com quantidade de DNA conhecida, permite estimar a quantidade na amostra em estudo. 3

4 Pela análise eletroforética, conclui-se que o DNA genómico da Drosophila melagnoster tinha um peso molecular de cerca de Pb (é o componente mais pesado da amostra, logo migra uma menor distância no gel, correspondendo à primeira banda dos poços 2, 3 e 5). A presença de outras bandas nestes poços pode indicar a existência de contaminação (para além da com proteínas e fenol, determinada pelo método anteriormente descrito, o RNA também pode estar presente, uma vez que contém bases azotadas, logo, o brometo de etídeo intercala-se entre elas): a última banda dos poços 2, 3 e 5 poderá corresponder à presença de mrna e trna, enquanto que as bandas intermédias, um pouco difusas, poderão ser relativas à presença de rrna (das subunidades ribossomais grande e pequena), já que para além de mais pesado (e, portanto, movimenta-se menos), é também o RNA mais abundante, daí a maior intensidade das bandas. Nos poços 3 e 5, essas bandas poderão também corresponder a possível DNA fragmentado. De modo a eliminar-se a contaminação com RNA, poderia ter-se recorrido à adição de RNAses, que degradariam o RNA, tornando a amostra de DNA mais pura. Quanto ao poço 4, o facto de se ter submetido a amostra a elevadas temperaturas poderá ter levado ao supercoiling do gdna, fenómeno que o torna mais pequeno e, por isso, há uma maior migração no gel, o que explica o facto de não se observar nenhuma banda nesse poço (poderá ter corrido mais que o marcador de pesos moleculares). Por outro lado, também há a hipótese das incorrecta pipetagem no poço, levando à dispersão da amostra no gel antes da eletroforese começar. Assim, partindo da primeira possibilidade em relação ao poço 4, e dada a semelhança entre os poços 2, 3 e 5, pode concluirse que apenas as altas temperaturas podem destruir o gdna, ao contrário dos outros tratamentos físicos, múltiplas pipetagens e vórtex vigoroso, que não aftam a integridade do gdna. 4

5 Extração de DNA plasmídico de Escherichia coli Objetivo Preparar em pequena escala o plasmídeo psk polo de Escherichia coli (E.coli), separando e isolando o DNA plasmídico da bactéria. Alterações ao procedimento experimental Após se colocar 1.5 ml de cultura num tubo Eppendorf, procedeu-se à centrifugação a velocidade máxima durante apenas 1 minuto e não durante 3 minutos como descrito no protocolo. Avançou-se o passo de deixar incubar 5 minutos à temperatura ambiente após adicionar 4 L de lisozima ao sedimento. Já no último passo relativo à extração do DNA plasmídico aplicaram-se 10 L de amostra (ao invés dos 5 L referidos no protocolo) com 5 L de tampão de aplicação. Na preparação do gel de agarose, não se adicionou 1 L de brometo de etídeo mas sim 3 L Resultados experimentais Figura 1 Eletroforese em gel de agarose. Marcador de pares de bases (1); os poços de (2) a (5) são referentes ao trabalho Extração de DNA genómico de Drosophila Melanogaster ; DNA plasmídico (6); os poços de (7) a (10) dizem respeito ao trabalho Análise eletroforética de DNA digerido com enzimas de restrição Discussão dos resultados/ Conclusão De acordo com a observação da Figura 1, é possível afirmar que o DNA plasmídico revela ter um menor peso molecular que o DNA genómico, uma vez que foi o que apresentou uma banda de maior migração no gel, o que seria de esperar na medida em que estas porções de material genético são pequenos fragmentos do DNA bacteriano circular. Pela análise dos resultados obtidos por eletroforese, observa-se a existência de 2 bandas embora muito ténues - no poço 6, a nossa amostra de DNA plasmídico. Relativamente à banda que migrou menos, infere-se que poderá corresponder a dsdna (double-stranded DNA). Por outro lado, a banda de interesse, aquela que migrou mais no poço 6 que corresponde a DNA plasmídico parcialmente purificado, (cccdna - covalently closed circular DNA), é a que apresenta menor peso molecular, uma vez que se trata de uma forma mais compacta de DNA plasmídico dado o super-enrolamento (supercoilling effect) que lhe confere uma estrutura de menor raio hidrodinâmico que lhe permite uma maior mobilidade ao longo dos poros do gel de agarose. Por outro lado, ainda pode haver a possibilidade do DNA plasmídico estar contaminado com fragmentos de RNA uma vez que este migra distâncias próximas do DNA plasmídico dado o seu pequeno tamanho, além de a banda detetada com menor peso ser larga. Pode dizer-se que a banda apresenta um peso molecular na ordem dos pb, sendo este o

6 Caderno de relatórios de Biologia Molecular intervalo de valores para o peso do DNA plasmídico, podendo conter vestígios de RNA. Uma forma de tirar dúvidas relativamente a este parâmetro e de concluir com certeza a ausência de RNA seria a realização do tratamento da amostra com RNAses que degradam o RNA e realizar nova eletroforese. 6

7 Análise eletroforética de DNA digerido com enzimas de restrição Objetivos Estudar a ação das enzimas de restrição EcoR I e Hind III na digestão de uma amostra de DNA plasmídico e analisar o resultado dos cortes através da eletroforese em gel de agarose. Alterações ao procedimento experimental Na preparação das amostras, procedeu-se à preparação de 4 tubos Eppendorf diferentes. O primeiro tubo o de controlo continha apenas 2 L de DNA plasmídico e os restantes 18 L de água pura; o segundo tubo com EcoR I foi preparado de acordo com o protocolo assim como o terceiro tubo tubo com Hind III -; o último tubo Eppendorf preparado com as duas enzimas de restrição continha 2 L de DNA plasmídico, 2 L de tampão, 1 L de EcoR I e 1 L de Hind III e, por fim, 14 L de água pura. A incubação a 37ºC durou apenas 45 minutos (aproximadamente). Resultados experimentais Figura 1 Eletroforese em gel de agarose. Marcador de pares de bases (1); os poços de (2) a (5) são referentes ao trabalho Extração de DNA genómico de Drosophila Melanogaster ; DNA plasmídico (6); DNA plasmídico não digerido (7); DNA digerido com EcoR I (8); DNA digerido com Hind III (9); DNA digerido com EcoR I e com Hind III (10) Tabela 1 Valores referentes aos pesos moleculares referentes ao marcador, à distância migrada de cada banda e ao logaritmo dos pesos moleculares PM / pb d migrada /cm log (PM) A partir da regressão linear do logaritmo dos pesos moleculares (log PM) em função da distância migrada (d) obtém-se a seguinte equação: log (PM) = d r 2 = Aplicando a equação obtida às bandas correspondentes às amostras obtêm-se os pesos moleculares apresentados na tabela 4.

8 Tabela 2 Valores referentes às distâncias de migração das bandas das amostras e respetivos pesos moleculares o peso molecular do fragmento inserido é de aproximadamente 1200 pb. Controlo EcoR I d migrada /cm PM/ pb Hind III Hind III + EcoR I Discussão dos resultados e Conclusão Analisando o gel de agarose da figura 3, verifica-se que no poço 7 se identificam 2 bandas e uma terceira muito ténue, sendo as 3 bandas referentes às 3 formas de DNA plasmídico: DNA circular, DNA linear de cadeia dupla e DNA superenrolado. No poço 8 com DNA digerido com EcorI observam-se duas bandas, o que indica que existem dois locais de corte no plasmídeo recombinante. Originam-se, assim, dois fragmentos com pesos moleculares de, aproximadamente, 5000 e 1200 pb. Pode concluir-se que apenas existe um local de corte para a enzima de restrição HindIII analisando o poço 9 -, originando uma banda correspondente a um fragmento de DNA com peso molecular de cerca de 5600 pb. A presença de uma única banda (correspondendo a um local de corte) indica que o plasmídeo perde a sua conformação circular e adquire uma conformação linear Tendo sido o plasmídeo digerido com as duas enzimas (EcorI e HindIII) poço 10 observam-se três bandas, indo de encontro ao esperado. A inserção do gene polo foi feita entre um corte de EcoRI e HindIII. Assim, conclui-se que 8

9 Elaboração do mapa de restrição de um plasmídeo recombinante Objetivos Elaborar o mapa de restrição de um plasmídeo recombinante que contém um gene que codifica para uma subunidade da NADH desidrogenase. Proceder-se à análise dos pesos moleculares dos fragmentos obtidos após digestão dos plasmídeos com as enzimas de restrição Sal I, Hind III, Pst I, Xho I, Pvu II, Sac I e BamHI. Alterações ao procedimento experimental Não houve quaisquer alterações ao procedimento experimental. Figura 2 Eletroforese onde se inseriu o fragmento L Resultados experimentais Tabela 1 Valores referentes aos pesos moleculares referentes ao marcador, à distância migrada de cada banda e ao logaritmo dos pesos moleculares do fragmento L Figura 1 Eletroforese onde se inseriu o fragmento R PM / pb d migrada /cm log (PM) Reta de calibração: log (PM) = d

10 Log (PM) Log(PM) Licenciatura em Bioquímica y = x R² = Distância migrada / cm Gráfico 1 Representação gráfica da distância migrada pelos marcadores de peso molecular em função do logaritmo do seu peso molecular e respetiva regressão linear (correspondente à eletroforese relativa ao fragmento L) y = x R² = Distância migrada / cm Gráfico 2 Representação gráfica da distância migrada pelos marcadores de peso molecular em função do logaritmo do seu peso molecular e respetiva regressão linear (correspondente à eletroforese relativa ao fragmento R) Tabela 2 Valores referentes aos pesos moleculares referentes ao marcador, à distância migrada de cada banda e ao logaritmo dos pesos moleculares do fragmento R PM / pb d migrada /cm log (PM) Reta de calibração: log (PM) = d Tabela 3 Enzimas de restrição utilizadas, distâncias migradas e respetivos pesos moleculares das bandas dos fragmentos R e L Fragmento L Fragmento R Enzima PM/ PM/ d migrada /cm d pb migrada /cm pb BamHI Sal I Hind III Pst I Xho I Pvu II Sac I Xho I Sac I

11 Construção do mapa de restrição do vector pgem-3 com os fragmentos L e R Exemplo para o fragmento L Em primeiro lugar, é possível determinar o peso molecular do pgem-3 (sem o fragmento inserido), através do corte do plasmídeo com a enzima de restrição BamH I (apresenta apenas uma banda, cujo peso molecular corresponderá ao do pgem-3): 3427 pb. Observando o poço relativo à restrição da Sal I, nota-se que um dos fragmentos correu uma distância muito semelhante ao pgem-3 no poço correspondente à ação da enzima referida anteriormente. Logo, esse corresponderá ao vetor (cujo peso molecular é coincidente com o obtido pela restrição da BamH I) e o outro componente será o fragmento L. Portanto, como base na tabela 3, este tem 3754 pb de peso molecular. Tendo conhecimento que a Sal I corta o pgem-3 na posição 25, já é, então, possível saber onde se situa o fragmento, uma vez que foi inserido nesse local de corte. O segundo corte situa-se no local 3779 (3754 pb + 25 pb). Relativamente à enzima Hind lll, sabe-se que esta cisa em dois locais distintos, dado que se observam duas bandas na eletroforese. Sabe-se, ainda, que corta o pgem-3 no local 7. Assim, o outro local de corte irá situar-se no fragmento L (pois o vetor só é cortado uma única vez), a cerca de 2174 pb do primeiro, isto é, na posição 2181 (chegar-se-ia a uma posição semelhante caso fosse feito o processo inverso, isto é, pelo lado contrário ao dos ponteiros do relógio, subtraindo ao total o número de pares de bases do fragmento maior obtido). Quanto à enzima Pst l, tal como a Hind lll, também corta duas vezes o plasmídeo recombinante, uma delas na posição 23 do vetor e a outra no fragmento L, 1985 pb à frente do primeiro corte, portanto, no lugar Em relação à enzima de restrição Pvu II, como nas anteriores, verificou-se a existência de duas bandas. Como o primeiro corte se dá na posição 104 do vetor (a 79 pb do local de inserção do fragmento), então, localizar-se-á na posição 3858 (79 pb pb, nº de pares onde termina o fragmento). O outro local de corte será no fragmento, no local 3395 (3858 pb 463 pb). O poço relativo à restrição da enzima Sac I tem apenas uma banda, cuja distância migrada é a menor de todas as bandas observadas, logo, o fragmento terá maior número de pares de bases, pelo que se pode concluir que corresponderá ao plasmídeo recombinante (pgem-3 + fragmento L), que no seu total contém, segundo este raciocínio, 7099 pb. Sabendo que esta enzima digere o pgem-3 no local 56, o seu corte será na posição 3810 (56 pb 25 pb = 31 pb; 3779 pb + 31 pb = 3810 pb, uma dedução análoga à anterior). Por fim, como a Xho l não corta o pgem-3, não seria possível saber os seus dois locais de corte (visto que se observaram duas bandas no poço correspondente aos fragmentos obtidos após o seu corte) sem informação adicional, uma vez que ambos se situarão no fragmento, do qual não temos conhecimento. Assim, para a sua localização, é necessário recorrer aos resultados da restrição simultânea da Xho I e Sac I. Em conjunto, estas cortam em 3 sítios distintos, originando 3 fragmentos com diferentes pesos. Já se tendo determinado o local de corte da Sac I, verifica-se que um dos locais de corte da Xho I estará 1985 pb para trás desse, isto é, na posição 1825, e o segundo corte estará 1050 pb para trás desse, no local 775 (o peso molecular do fragmento obtido entre estes cortes, 1050 pb, é coincidente com o obtido com a restrição da Xho I isoladamente). Foi utilizado o mesmo método para a construção do mapa de restrição relativo ao plasmídeo recombinante resultante da inserção do fragmento R no pgem-3, uma vez que as enzimas de restrição usadas foram as mesmas. 11

12 Figura 3 Mapa de restrição resultante da ação de várias enzimas de restrição no plasmídeo recombinante (proveniente da inserção do fragmento L no vector pgem-3). Figura 4 Mapa de restrição resultante da ação de várias enzimas de restrição no plasmídeo recombinante (proveniente da inserção do fragmento L no vector pgem-3.

13 Discussão dos resultados/ Conclusão Neste trabalho prático foi possível compreender como se processa toda a metodologia para a construção de um mapa de restrição, desde a análise eletroforética à comparação dos pesos moleculares dos vários fragmentos, obtidos a partir da reta de calibração do gráfico Log (Peso Molecular) = f (distância migrada). estudo ganha extrema relevância quando se pretende, por exemplo, escolher fragmentos de DNA de menores dimensões para posterior subclonagem ou identificar fragmentos de DNA homólogos. De notar que este estudo permitiu uma análise relativa entre os cortes das várias enzimas de restrição, não sendo, portanto, de elevado rigor. Por exemplo, a soma dos pesos moleculares do vetor pgem-3 e de cada fragmento não é igual ao peso molecular do plasmídeo recombinante (pgem-3 e o fragmento nele inserido) que é dado, supostamente, pela restrição com Sac I (no caso do fragmento L, o peso molecular obtido para o fragmento resultante do corte com Sac I foi de 7099 pb e não 3427 pb pb = 7181 pb; no fragmento R obteve-se 7486 pb e 7561 pb, respetivamente). Por outro lado, a soma dos pesos moleculares dos fragmentos resultantes, no caso das enzimas que cisam mais do que uma vez, deveria ser a mesma em todos os casos e igual ao obtido com a restrição da Sac I. Contudo, embora não sejam exatamente iguais, não diferem significativamente. Estas observações revelam que, embora os resultados sejam relativamente aproximados, este é um bom método para determinar a localização física, ainda que relativa, dos locais de corte de várias enzimas. Este tipo de

14 PCR Polimerase Chain Reaction Objetivos Amplificar uma sequência de DNA genómico e de uma sequência de cdna por PCR. Analisar a eficiência e características do gdna e do cdna por eletroforese. Alterações ao procedimento experimental Na preparação das misturas de reação, adicionou-se 4 L de dntp s a cada tubo Eppendorf e não os 8 L referidos no protocolo. Realizaram-se 15 ciclos no amplificador termocíclico ao invés de 40 ciclos. Resultados experimentais Desenho dos primers O primer sense foi obtido através das regras existentes no protocolo e foi desenhado a partir da cadeia 5-3. Por sua vez, o primer antisense foi obtido a partir da cadeia 3-5 pois terá de ser complementar às bases que compõem a sequência escolhida, já que tem de a polimerizar. Extremidade 5 da sequência sense da porção para amplificar: 3 -CGGTTAACGGTTTTTCC-5 antisense primer Este primer, tal como o anterior, é constituído por 17 nucleótidos, dos quais 8 são citosinas ou guaninas (47% de G/C) e também apresenta uma temperatura de hibridação de 50ºC. Desta forma, o par de primers pode ser usado para efetuar PCR na medida em que ambos têm um número total de nucleótidos de 17 (dentro dos parâmetros entre 17 a 25 nucleótidos), o seu conteúdo em guaninas+citosinas está dentro do estipulado (entre 45 e 55%) e a T o m de ambos é a mesma. Portanto, estão reunidas as condições necessárias à realizaçãoo de uma PCR eficaz. Eletroforese De forma a avaliar a quantidade de produto obtido na PCR foi necessário efetuar uma eletroforese em gel de agarose 1%, apresentada abaixo na imagem 1: AGCTATGCTATGCTATGCTAGCCAGTCA GCTGAACGTG 3 5 GCTATGCTATGCTATGC 3 primer sense Este primer é constituído por 17 nucleótidos: 8 são citosinas ou guaninas (47% de G/C) e apresenta uma temperatura de hibridação de 50ºC. Extremidade 3 da sequência antisense: 3 AGATTAAGGTTCGGTTAACGGTTTTT CCTTGGC-5 Figura 1 Resultado da eletroforese respeitante à amplificação do produto obtido por PCR de cdna (2) e gdna (3), o poço 1 corresponde aos marcadores de peso molecular. 14

15 log (PM) Licenciatura em Bioquímica [Nota: A eletroforese apresentada corresponde ao PCR realizado na turma 2, uma vez que na nossa turma não existiam bandas relativas aos pesos moleculares, talvez porque aquando da aplicação no poço, a solução possa ter sido difundida no gel e não entrar toda no poço, não sendo observáveis bandas e, portanto, impossibilitanto o cálculo do peso molecular das amostras] Procedeu-se à medição das distâncias migradas pelo marcador de peso molecular, cujos valores se apresentam na Tabela 1: Tabela 1 Valores referentes aos pesos moleculares referentes ao marcador, à distância migrada de cada banda e ao logaritmo dos pesos PM / pb d migrada /cm log (PM) moleculares log (PM) = -0,3871 d + 4,6444 R² = 0, distância migrada / cm aos pontos e valor de coeficiente de correlação (R 2 ). Figura 2 Representação gráfica do logaritmo de pesos moleculares do marcador em função da distância percorrida, respetiva equação da regressão linear e valor de coeficiente de correlação Depois de medir as distâncias percorridas por cada uma das amostras, aplicou-se a equação obtida às bandas correspondentes às amostras obtendo-se os pesos moleculares sumariados na tabela 2. Tabela 2 Valores referentes à migração de cdna e gdna em gel de agarose e respetivo peso molecular d migrada /cm PM cdna 4,9 551 gdna 4,7 659 Realizando-se a regressão linear do logaritmo dos pesos moleculares (log PM) em função da distância migrada (d) obtém-se a seguinte representação gráfica, além da respetiva equação da regressão linear que mais se ajusta Discussão dos resultados/ Conclusão O primeiro ponto do trabalho prático era o desenho dos primers a serem usados na reação de PCR. O par de primers desenhados pode ser usado para efetuar PCR na medida em que ambos têm 15

16 um número total de nucleótidos de 17 (dentro dos parâmetros entre 17 a 25 nucleótidos), o seu conteúdo em guaninas+citosinas está dentro do estipulado (entre 45 e 55%) e a T o m de ambos é a mesma. Portanto, estão reunidas as condições necessárias à realização de uma PCR eficaz e obtenção de sucesso na amplificação. Para além disso, na extremidade 3 de ambos os primers detetam-se 2 resíduos G ou C, o que vai ajudar a uma correta hibridação neste local devido às fortes interações por pontes de hidrogénio entre os pares de bases G/C. Outro fator importante é a ausência de sequências complementares na mesma cadeia, para impedir a formação de estruturas secundárias e de homologias entre primers, evitando o emparelhamento entre eles. Estes dois aspetos referidos anteriormente são cruciais para que a formação de dímeros não ocorra, pois eles são sintetizados preferencialmente em relação a qualquer outro produto de PCR desejado. No ponto relativo à amplificação por PCR é importante referir que o gdna é mais pesado que o cdna (peso molecular mais elevado). Isto está relacionado com o facto de o cdna ser obtido por complementaridade de bases com o mrna através da ação da enzima transcriptase reversa. Assim, como não possui intrões, dado que estes são removidos durante o processamento do mrna (RNA splicing), o cdna apresenta apenas a região codificante, sendo mais leve. O mesmo não se passa com o gdna que possui intrões, exões e fragmentos reguladores da expressão génica, ou seja, tem na sua constituição toda a informação genética. Desta forma, é de esperar que a distância migraada pelo cdna seja maior na medida em que tem um número de bases inferior ao gdna. Além das bandas de interesse (as mais evidentes), existe o aparecimento de outras bandas de maior peso molecular (migram menor distância) e é importante fazer uma discussão consciente do seu aparecimento e a que correspondem. Relativamente ao cdna verificase o aparecimento de 3 bandas extra, enquanto que no gdna é possível observar apenas uma, além da mais evidente. Isto pode dever-se ao facto de, nas reações de PCR efetuadas, como foram realizados menos ciclos do que os devidos (foram realizados 15 em vez de 40), o gel foi muito mais corrido, levando ao aparecimento, além do produto obtido, da template que normalmente não é vísivel na eletroforese porque está bastante diluída, mas provavelmente foi o que aconteceu para a observação dessas bandas extra. Assim, as bandas mais ténues nos poços 2 e 3 podem deverse a fragmentos de DNA obtidos nos primeiros ciclos de PCR, pois neste caso o tamanho da cadeia ainda não é fixo. Já a banda mais intensa corresponde ao gene polo amplificado por PCR propriamente dito. 16

17 Transformação de Escherichia coli com DNA plasmídico Objetivos Transformar E.coli com DNA plasmídico. Transformar as células com plasmídeo pembl9, pembl9 CAT, pbr322 e pbr322 CAT. Avaliar a eficiência da transformação. Alterações ao procedimento experimental Não houve alterações ao procedimento experimental. Resultados experimentais Figura 3 -Placas com meios de cultura LA/Amp e Mac/Amp incubadas com plasmídeos pembl9- CAT Figura 1 - Placa com meio de cultura LA/Amp. Controlo Figura 4 - Placas com meios de cultura LA/Amp e LA/Amp/tet incubadas com plasmídeos pbr322 Figura 2 - Placas com meios de cultura LA/Amp e Mac/Amp incubadas com plasmídeos pembl9 Figura 5 - Placas com meios de cultura LA/Amp e LA/Amp/tet incubadas com plasmídeos pbr322-cat

18 Tabela 1 Contagem das colónias e avaliação da cor para as diferentes placas Figura 6 - Placa com meio de cultura Mac/Lac/Clo incubada com plasmídeos pbr322- CAT Meio de Nº de Plasmídeo Cor cultura colónias Controlo LA/Amp 0 - LA/Amp 700 Amarelo pembl9 Mac/Lac/Amp 500 Vermelho pembl9- CAT pbr322 pbr322- CAT LA/Amp 100 Amarelo Mac/Lac/Amp 50 Vermelho LA/Amp 25 Amarelo LA/Amp/Tet 0 Amarelo LA/Amp 100 Amarelo LA/Amp/Tet 0 Amarelo Tabela 2 Resultados observados aquando da transferência dos plasmídeos do seu meio inicial para o meio Mac/Clo. Plasmídeo Meio de Cultura Crescimento pbr CAT Mac/Clo Não pembl 9 Mac/Clo Não pembl 9 - CAT Mac/Clo Sim Figura 7 - Placa com meio de cultura Mac/Lac/Clo incubada com plasmídeos pembl9 Figura 8 - Placa com meio de cultura Mac/Lac/Clo incubada com plasmídeos pembl9- CAT Discussão dos resultados e Conclusão Analisando os resultados obtidos, verificase que ocorreu transformação das bactérias com os diferentes tipos de plasmídeos usados, pois nos meios contendo LA/Amp as colónias cresceram, ou seja, o gene de resistência à ampicilina foi incorporado e expresso com sucesso em todos os plasmídeos. Ainda, a disparidade de número de colónias que cresceram em LA/Amp nas placas com diferentes plasmídeos prende-se com o facto de uns serem mais resistentes que outros. Tal não se verficou apenas para o controlo, visto que neste caso as bactérias não tinham sido transformadas e, naturalmente, não possuíam a resistência ao antibiótico. 18

19 Além da resistência à ampicilina, o plasmídeo pembl9 possui o gene que codifica para a β-galactosidase, e então, quando está presente em meio Mac/Lac/Amp (contém lactose), crescem colónias de cor avermelhada. Assim, este meio induziu a expressão da β- galactosidase e a cor vermelha apresentada devese ao facto desta enzima dar origem a produtos acídicos (ácido pirúvico) durante a glicólise, o que faz diminuir o ph. Tal diminuição é detetada pelo indicador de MacConkey presente no meio em questão que, quando o ph apresenta valores baixos, indica a cor avermelhada. O mesmo não se verificou para o pembl9-cat, cujas colónias cresceram mas apresentam cor amarela/branca, uma vez o gene CAT, sendo inserido no meio do gene que codifica para a β-galactosidase, impediu expressão da β-galactosidase e assim, já não se observa a degradação da lactose com a consequente formação de ácidos. No que diz respeito às bactérias transformadas com o plasmídeo pbr322, que tinha na sua constituição genes que codificam para a resistência a dois antibióticos, a ampicilina e a tetraciclina, seria de esperar um crescimento tanto para o meio LA/Amp como para LA/Amp/tet. No entanto, tal não se verificou para o meio LA/Amp/tet, o que pode levar a inferir que, provavelmente, o gene de resistência à tetracicnlina não foi coreretamente inserido. Por outro lado, na presença do gene CAT, a sua inserção é feita no meio do gene que codifica para a resistência à tetraciclina, ou seja, a resistência não é expressa e as bactérias não sobrevivem ao meio contendo este antibiótico, observando-se que na placa contendo pbr322-cat em LA/Amp/tet não há crescimento de colónias, como seria de prever. Na placa contendo LA/Amp continua a haver crescimento das colónias na medida em que a inserção do gene CAT não implica a expressão do gene de resistência à ampicilina, uma vez que não é inserido na porção referente a esta resistência. Finalmente, é importante fazer referência à resistência das bactérias ao clorofenicol, que é induzida pela expressão do gene CAT. Sendo assim, seria de esperar crescimento em meio Mac/Clo das bactérias transformadas com pembl9-cat e pbr322-cat, enquanto que as com pembl9, por não ter sido inserido o gene CAT, não devem crescer pois não são resistentes ao clorofenicol. Contudo, apenas as bactérias transformadas com pembl 9 CAT cresceram. A razão para a ausência de crescimento de bactérias com pbr322 CAT poderá prender-se com um mau acondicionamento das colónias, uma transferência do meio inicial para o meio Mac/Clo pouco eficiente, além de se poder especular sobre o facto de as colónias transferidas serem, efetivamente, resistentes ao clorofenicol, na medida em que as bactérias transformadas com pbr322- CAT, apesar de terem o gene, podem não conseguir expressá-lo devido à falta dos elementos do promotor para se dar a transcrição. 19

20 Sequenciação de DNA Objetivos Sequenciar um gene pelo método de Sanger. Isolar uma proteína por métodos bioquímicos e determinar a sequência dos primeiros dez aminoácidos da região N-terminal. Alterações ao procedimento experimental Não houve alterações ao procedimento experimental. Resultados experimentais Sequência de aminoácidos: N terminal-ser-tyr-cys-leu-pro-met-ser-pro- Arg-Ala-C terminal Assim, temos diversas possibilidades para a sequência de nucleótidos que codifica esta sequência de aminoácidos: T/A C/G T/C/G/A T A T/C T G C/T C/T T A/G/C/T C C T/A/G/C A sequência reconhecida pela enzima de restrição EcoRI é : GAATTC A sequência reconhecida pela enzima de restrição HindIII é: AAGCTT Pela análise dos resultados da eletroforese (em anexo), é possível determinar a sequência de aminoácidos de 3 para 5 (cadeia antisense), pelo que é necessário, posteriormente, formar a cadeia complementar (cadeia sense 5 -> 3 ), obtendo-se assim as sequências: Sequência da amostra B 5 TAGCGAATTCATTATCCCGATCTAGTAA CGCATCCTCTAACTAGCGTGAATTATGTCATATTGCC TGCCCATGTCCCCGCGTGCGAAGCTTCGCCTA-3 Sequência da amostra C 5 -TAGCGAATTCAATCGACCCAGGTCACAACC TTCCGGCTCAAGCCTAACCTAGTTAAGACCCTATGTC TCCCCGAGCTAAGCTTCGCCTA-3 Os locais de restrição de EcoRI e HindIII estão sinalizados a azul e a verde, respetivamente; a cinzento está assinalado o codão de iniciação. O primer usado na amplificação por PCR hibridou com cada uma das sequências a negrito, sendo as sequências dos primers para cada um dos clones as seguintes: A- 3 - GGGTACAGCGGGGCA - 5 B- 3 - GGGTACAGGGGCGCA - 5 C- 3 GGATACAGAGGGGCT - 5 De modo a identificar qual dos clones codifica a sequência de aminoácidos pretendida, verifica-se qual a sequência (A, B ou C) que apresenta os codões que codificam para cada um dos aminoácidos da sequência. Assim verifica-se que o clone em causa é o B. 5 -TCATATTGCCTGCCCATGTCCCCGCGTGCG-3 N-terminal-Ser-Tyr-Cys-Leu-Pro-Met-Ser-Pro-Arg- Ala-C-terminal Sequência da amostra A 5 TAGCGAATTCACCAGGTTCCGAACATCGC CATTCCAGGGAACTCATTGAGTCTAGCCTAACTAACG ACCCATGTCGCCCCGTGAAAAGCTTCGCCTA-3 20

21 Discussão dos resultados/ Conclusão Pelo método de Sanger, foi possível determinar a sequência de nucleótidos correspondente à sequência de aminoácidos fornecida (obtida por espectroscopia de massa). Para além disso, foi descoberto o clone que codifica para a sequência de aminoácidos em causa. Pode, ainda, determinar-se a sequência dos primers utilizados em cada um dos PCR s dos diferentes clones. Analisando as sequências nucleotídicas, verificou-se a existência de uma sequência comum aos três: os dois primeiros nucleótidos são iguais, diferindo apenas no terceiro. Portanto, codificam o mesmo aminoácido, a prolina. O método de Sanger é o mais usado no que se refere à sequenciação de DNA. A determinação da sequência de um gene é de enorme relevância, dada a possibilidade de, a partir disso, se proceder à caracterização da estrutura genética, o que auxilia no estudo da regulação e expressão desse gene. Tais estudos são uma potencial ajuda ao nível do progresso das investigações em vários campos, como a medicina (no que toca à cura de diversas patologias, nomeadamente com origem genética). 21

22 Clonagem de cdna - γ-tub Objetivos Clonar o gene de cdna - γ-tub. Verificar experimentalmente o resultado da transformação de bactérias com DNA com diferentes tratamentos. Figura 1 Placas resultantes do crescimento de colónias de bactérias transformadas com a mistura reacional A e B, respetivamente. Alterações ao procedimento experimental A digestão e purificação do DNA foi realizada segundo o procedimento experimental sem qualquer alteração. No entanto para se proceder à ligação, prepararam-se 4 tubos (A, B, C e D) em vez de apenas um. Os tubos A, B, C e D continham os volumes indicados abaixo de vetor, insert, tampão (5x), T4 ligase e de água. Tabela 1 Volumes de vetor, insert, tampão, T4 ligase e água necessários à preparação dos 4 tubos A B C D Vetor 5 L 5 L - 5 L Insert 10 L 10 L 10 L - Tampão 4 L 4 L 4 L 4 L (5x) T4 ligase 1 L - 1 L 1 L Água - 1 L 5 L 10 L A transformação foi realizada em laboratório pelo que se assume que não tenha havido alterações ao procedimento experimental. Resultados experimentais Figura 2 Placas resultantes do crescimento de colónias de bactérias transformadas com a mistura reacional C e D, respetivamente Discussão dos resultados/ Conclusão A reação A corresponde ao conjunto de células incubadas em que se deveria verificar a clonagem do gene, no entanto isto não acontece pois não se verifica o aparecimento de colónias amarelas que, não expressando o gene LAC, não produzem -galactosidase e, por isso, não originam o abaixamento de ph. Observam-se, nesta placa, apenas colónias vermelhas, o que significa que produzem -galactosidase que degrada a lactose, originando ácidos, levando à dimnuição do ph (é este fator que provoca a cor vermelha das colónias). Assim, é possível concluir que as bactérias do tubo A não incorporaram cdna, na medida em que este é incorporado no meio do gene LAC, impedindo a sua expressão. Ora, se todas as colónias são vermelhas é porque o gene LAC é expresso. As placas B e C não apresentam colónias, conforme o esperado. Na primeira (placa B) não existe T4 ligase que permite que o insert se ligue

23 ao vetor ou que este recircularize, por isso, não se esperava o crescimento de colónias. Na segunda placa (C), não existe vetor pelo que também não se pode verificar o crescimento de colónias pois o insert não se pode ligar a si mesmo. No que diz respeito à placa D, observa-se o crescimento de colónias com cor vermelha. Nesta placa colocaram-se células sem insert pelo que as colónias que se observam correspondem ao vetor re-circularizado. As bactérias resistem à ampicilina e produzem -galactosidase, o que faz com que todas as colónias apresentem cor vermelha devido à diminuição do ph, como explicado para o caso da reação A, em que, não havendo cdna para ser incorporado, o gene LAC continua a ser expresso. Concuindo, a clonagem foi mal sucedida e isso pode dever-se a vários fatores: a purificação do DNA pode não ter corrido bem, o rácio entre a quantidade de insert e vetor pode não ter sido a mais indicada para o processo ocorrer da melhor forma e podem ter ocorrido problemas enzimáticos. No entanto, a inatividade da T4 ligase é um fator que não deverá ser usado para a argumentação na medida em que na placa D o vetor recircularizou, ou seja, a T4 ligase está ativa e portanto as bactérias cresceram nesse meio. 23