Alexandre Havt. Estrutura dos Ácidos Nucléicos. DNA e RNA Replicação Transcrição Tradução Introdução à Biologia Molecular

Transcrição

1 Estrutura dos Ácidos Nucléicos DN e RN Replicação Transcrição Tradução Introdução à Biologia Molecular lexandre Havt Moléculas com informações para a síntese de proteínas DN armazém ou biblioteca celular ontém informações para a construção das células e tecidos Duplicação dos genes garante a perpetuação das espécies Transcrição síntese de RN RN mensageiro (mrn) RN transportador (trn) RN ribossômico (rrn) Tradução síntese de proteínas a partir das informações dos RNs Descoberta da estrutura do DN em 1953 Watson e rick Estrutura dos Ácidos Nucléicos DN e RN Estrutura dos Ácidos Nucléicos DN e RN Estrutura dos Ácidos Nucléicos DN e RN Estrutura dos Ácidos Nucléicos - DN 1

2 Estrutura dos Ácidos Nucléicos - RN RN mensageiro - mrn Ribossomos Procariotos itoplasma Eucariotos Mitocôndrias Procariotos 3 tipos de moléculas de rrn 16S + 21 proteínas 30S 23S 70S +34 proteínas 50S 5S itoplasma de eucariotos 4 tipos de moléculas de rrn 18S + 33 proteínas 40S 5S 80S 28S +50 proteínas 60S 5,8S Mitocondriais 55S Propriedades similares ao das bactérias RN ribossômico - rrn Função Transportar aminoácidos para a síntese protéica ssegurar a incorporação dos mesmos na posição correta anticódon élulas com pelo menos 20 trn Pequenas moléculas 80 nucleotídeos 4S RN transportador - trn Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e Proteínas Regras da Síntese dos Ácidos Nucléicos e Proteínas Formados por blocos monoméricos RN e DN 5 Nucleotídeos Proteínas 20 aminoácidos Monômeros adicionados 1 por vez adeia de formação tem ponto de partida específico com crescimento unidirecional para um terminal fixo Direção 5-3 Produto primário é frequentemente modificado 2

3 Replicação do DN Replicação do DN Duplicação do material genético para a divisão celular Replicação é semiconservativa ma fita parental e uma nova fita sintetizada Forquilha de replicação Helicases - Separação das duplas fitas Proteínas protegem DN de fita simples e evitam reaproximação Primase síntese de iniciador Topoisomerase Desenrolam supertorção Ligases união dos fragmentos de Okasaki DN polimerases α - associação com primase para formação do iniciador δ - polimerização das fitas líder e lenta γ - polimerização DN mitocondrial β ε κ η ζ ι - polimerases de reparo Replicação do DN Eucariótico Síntese de RN Transcrição Síntese de RN Transcrição Síntese de RN RN polimerases devem reconhecer O ponto de início da transcrição Qual das fitas deve ser usada como molde transcrita Região promotora do DN ontrola a ligação da RN polimerase Identifica o ponto de início da transcrição ontrola a frequência da transcrição Sequências regulatórias no promotor Sequências perto do promotor Reforçadores Interagem com proteínas que estabilizam a ligação RN-polimerase ao promotor 3

4 Transcrição Processamento do mrn Eucariótico Síntese dos rrns Eucarióticos Síntese dos trns Eucarióticos Síntese Protéica - Tradução Síntese de proteínas Tradução Ocorre nos ribossomos rrn Direcionado pela sequência dos códons de mrn ada trn traz um aminoácido específico ao seu anticódon minoacil-trn 4

5 Primeira base ódigo enético Segunda base Terceira base Formação do aminoacil-trn (5 ) Phe Phe Pro Pro Pro Pro Tyr Try Parada Parada His His ln ln ys ys Parada Trp rg rg rg rg (3 ) minoacil-trn trn ligado covalentemente a um aminoácido na terminação 3 ada aminoácido com seu trn lanil-trn ala Metionil-tRN i met 20 minoacil-trn-sintetases Ile Ile Ile Met Val Val Val Val Thr Thr Thr Thr la la la la sn sn Lys Lys sp sp lu lu rg rg ly ly ly ly Processo dependente de TP Ocorre em 2 passos Formação do complexo: enzima/aminoacil-mp e pirofosfato Transferência do aminoácido ativo Hidroxila do carbono 2 ou 3 da ribose Nucleotídeo de adenina () Processo da Tradução Iniciação Envolvimento de 3 passos Iniciação longamento Terminação longamento Ligação Peptídica Translocação Terminação ódons de parada Inexistência de trn com anticódons que possam parear com Fatores de liberação unem-se ao ribossomo Hidrólise da ligação peptidiltransferase adeia peptídica trn Peptídeo sintetizado é liberado Dissociação das subunidades do ribossomo Liberação do mrn 5

6 Polissomos Ligação de vários ribossomos ao mrn ada ribossomo cobre 80 nucleotídeos de mrn proximadamente um ribossomo a cada 100 nucleotídeos Técnicas de Biologia Molecular Reação de Polimerase em adeia PR Função - Multiplicação de trecho específico de DN Problema análise de ácidos nucleicos Baixa quantidade de ácidos nucléicos nos tecidos Karis Mulis Primers Taq DN polimerase (Thermus aquaticus) Enzima termoestável em temperatura até 117 Temperatura ótima 72 Início vários banhos maria com diferentes temperaturas 1987 publicação do artigo de Mulis na Methods in Enzymology 1989 primeiro termociclador 1994 Nobel em química para Karis Mulis Técnicas de Biologia Molecular Fundamentos do PR Desnaturação das cadeias de DN à 94 nelamento dos primers (de acordo com a TM de cada primer) Extensão incorporação dos nucleotídeos pela enzima Taq á 72 Técnicas de Biologia Molecular Vídeo da reação de PR Reagentes essenciais Taq em solução de Tris-HL (ph 8,0), 0,1 mm EDT, 1mM DTT, 50% glicerol Tampão 200 mm Tris-HL (ph 8,4), 500 mm Kl loreto de magnésio cofator para ação da enzima Desoxinucleotídios (TP, TTP, TP, TP) mistura de [ ] s iguais Primers específicos à sequência que se deseja amplificar Técnicas de Biologia Molecular Fundamentos da Transcriptase Reversa Vírus de RN tipo VI Enzima transcriptase reversa enoma de RN orienta a formação de uma molécula de DN MV - Vírus da Mieloblastose aviária M-MuL-V (Moloney Murine kemia Virus) Importante ferramenta para o estudo da expressão gênica a partir do mrn Síntese de uma fita de DN complementar de fita simples (cdn) Sequências de cdn específico podem ser amplificados por PR TTTTTTTTT mrn TTTTTTTTTTTTTT cdn TTTTTTTTT mrn TTTTTTTTTTTTTT cdn TTTTTTTTT mrn TTTTTTTTTTTTTTTT cdn RNse I TTTTTTTTT mrn TTTTTTTTTTTTTTTT cdn PR 6

7 Técnicas de Biologia Molecular Isolamento de RN Imprescindível uso de luvas e amostras no gelo quando possível evitar RNse Qualquer amostra tecidual, cultura de células - (100mg) Método muito utilizado Reagente TRIZOL Isolamento de RN por TRIZOL Fenol + Isotiocianato de guanidine Membranas celulares e nucleares destruídas Manutenção da integridade do RN Maceração da amostra com TRIZOL lorofórmio separação em 3 fases RN sobrenadante DN camada intermediária Protéinas camada inferior Precipitação com Isopropanol Lavagem com Etanol 75% Leitura em espectrofotômetro 260nm quantidade ( 260 x fator de diluição x 0,04 = [ ug/ul]) Razão 260nm/280nm qualidade do RN ( 2,00) mostra 100 mg + 1 ml de TRIZOL Remover sobrenadante transparente para novo tubo crescentar 500 ul de isopropanol Incubar RT 10 min entrifugar g p/ 15 min à 2 8 Descartar sobrenadante Homogeneizar Vórtex por 15 sec. Incubar RT p/ 2-3 min entrifugar g p/ 15 min crescentar 3x 1mL de etanol 75% entrifugar 3x a g por 5 minutos à 2 8 entrifugar g 10 min. 2-8 Remover sobrenadante p/ novo tubo crescentar 200 ul de clorofórmio Descartar 3 sobrenadante Evaporar etanol Solubilizar pellet com ddh 2 O autoclavada Leitura espectrofotômetro nálise por Eletroforese Principio básico O DN tem carga negativa plicando uma voltagem as moléculas de DN migrariam para o catodo Malha de gel de agarose permite o deslocamento do DN separandoo por tamanho Moléculas menores migram mais rápido Moléculas maiores migram mais lento distância percorrida é comparada à distância de uma molécula de tamanho conhecido nálise por Eletroforese Principio básico garose polissacarídeo é aquecido para dissolver em tampão eletrolítico Tris-cetato-EDT TE Tris- Borato-EDT Solubilização do gel por esfriamento umento da viscosidade da amostra com glicerol Visualizaçãoda corrida da amostra com corante bromofenol blue Visualização do DN no gel por brometo de etídeo uba de Eletroforese Horizontal 7

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