Introdução ao Acoplamento Cromatografia Líquida Espectrometria de Massas

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1 Introdução ao Acoplamento Cromatografia Líquida Espectrometria de Massas XVII MET Encontro Nacional sobre Metodologia e Gestão de Laboratórios da Embrapa Pirassununga, de Outubro de Amadeu Hoshi Iglesias Especialista de Aplicações em Espectrometria de Massas amadeu_iglesias@waters.com 2012 Waters Corporation 1

2 Agenda Conceitos e Fundamentos de Espectrometria de Massas Instrumentação Espectrometria de Massas Sequencial Acoplamento LC MSMS Desenvolvimento de Métodos Quantitativos por LC MS e LC - MSMS Screening com Tof 2012 Waters Corporation 2

3 Conceitos e Fundamentos de Espectrometria de Massas 2012 Waters Corporation 3

4 Espectrometria de Massas Técnica analítica para: identificação de compostos desconhecidos quantificação de compostos conhecidos. Sensibilidade: Substâncias podem ser detectadas com quantidades mínimas de amostra (10-12 g, mol pra um composto de massa 1000 Daltons. Seletividade: Substâncias podem ser identificadas e quantificadas em concentrações muito baixas (uma parte em ) em misturas complexas Waters Corporation 4

5 Definição IUPAC Espectrometria de Massas: Estudo de sistemas pela formação de íons em fase gasosa, com ou sem fragmentação, que são caracterizados por suas relações massa carga e abundâncias relativas Waters Corporation 5

6 Unidades em um espectro de massas m/z = relação massa/carga Daltons (Da) = u = unidade de massa atômica Thomson (Th) = m/z 100 m/z = Da/z = Th Ion abundance (%) m/z 2012 Waters Corporation 6

7 Espectro de massas Pico base (ion 100%) 100 Íons fragmento Pico do íon molecular (Precursor) Ion abundance (%) Isótopos m/z 2012 Waters Corporation 7

8 Isótopos Flurbiprofen (M+H) Thiomethoxam (M+H) % % m/z 0 m/z C 15 H 13 O 2 F C 8 H 10 N 5 O 3 S Cl 2012 Waters Corporation 8

9 Razão de Isótopos Elemento Isotopo Abundância Relativa +1 Isotopo Abundância Relativa Carbono 12 C C 1.11 Hidrogênio 1 H H Nitrogênio 14 N N Isotopo Abundância Relativa Oxigenio 16 O O O 0.20 Enxofre 32 S S S 4.40 Cloro 35 Cl Cl 32.5 Bromo 79 Br Br Waters Corporation 9

10 Espectro de massas H H O H C C H H H = 1 Da O = 16 Da H 2 O = 18 Da H H H = 1 Da O = 16 Da C = 12 Da C 2 H 6 O = 46 Da O H Mistura água + metanol intensidade intensidade intensidade 18 m/z m/z 46 m/z Gráfico m/z x Intensidade iônica 2012 Waters Corporation 10

11 Espectro de massas H 3 C CH 3 O CH 3 H 3 C Substância intacta O CH 3 O O O + H 2 C O N CH 3 N H 3 C CH 3 CH 3 H 2 C H 3 C O CH CH 3 3 CH3 3 C + O O O C O CH 2 + O N CH 2 + CH 3 NH 3 C CH 3 CH 3 NH 3 C CH 3 CH 3 Íons precursor e fragmentos 2012 Waters Corporation 11

12 Modos de Aquisição Hemoglobin auto01 4 (0.690) Sm (SG, 1x2.00); Cm (3:4) TOF LD+ 3.17e Contínuo % auto01 4 (0.690) Cn (Cen,1, 80.00, Ar); Sm (SG, 1x2.00); Cm (3:4) TOF LD Centróide % m/z 2012 Waters Corporation 12

13 Cromatograma Pesticide Mix pest % TIC (Total ion Chromatogram) : Scan ES+ TIC 5.77e6 0 pest % 4.65 Cromatograma m/z 229 1: Scan ES e6 0 pest % 5.10 Cromatograma m/z 217 1: Scan ES e5 0 pest Cromatograma m/z 199 1: Scan ES e6 % Time 2012 Waters Corporation 13

14 Parâmetros Analíticos Principais características que devem ser consideradas em um espectrômetro de massas: Sensibilidade Exatidão e precisão na medida de massas Resolução Faixa dinâmica Linearidade Reprodutibilidade A importância de cada parâmetro depende da aplicação 2012 Waters Corporation 14

15 Sensibilidade Medida como o valor de relação sinal/ruído para um padrão específico, em uma dada concentração Waters Corporation 15

16 Resolução 100% Relação massa/carga Largura do pico ( 50%) = 500 = 0.05Da 50% 0.05 Da Resolução (FWHM) = 500 = m/z FWHM = Full Width Half Maximum 2012 Waters Corporation 16

17 Exatidão de massa A exatidão da medida é calculada como a diferença (erro) entre a massa medida (experimental) e a massa teórica. A exatidão de massas é medida em milidaltons (1mDa = unidades de massa) ou ppm = partes por milhão = m/m x 10 6 Exemplo: Massa real = Massa medida = Diferença = ( 2 mda) Erro em ppm = x 10 6 = 5 ppm Waters Corporation 17

18 Exatidão de massa Massa nominal e massa exata de alguns elementos Massa Nominal Massa Exata Carbono Hidrogênio Oxigênio Nitrogênio Massa nominal e exata de algumas moléculas Massa Nominal Massa Exata C 8 H 7 NO C 9 H 11 N C 9 H 7 N Waters Corporation 18

19 Resolução e Exatidão de massa A resolução de um quadrupolo não é suficiente para diferenciar estes dois compostos. Dados de ToF com resolução >10,000, mostra claramente dois picos distintos. A massa destes picos pode ser medida com exatidão < 5ppm 2012 Waters Corporation 19

20 Cálculo para composição elemental Tolerância 5 ppm Tolerância 50 ppm 3 possibilidades 30 possibilidades! 2012 Waters Corporation 20

21 Linearidade Curva de calibração em uma faixa de 0.5 to 5000pg/µL na coluna R 2 = Compound name: verapamil Correlation coefficient: r = , r^2 = Calibration curve: * x Response type: External Std, Area Curve type: Linear, Origin: Exclude, Weighting: 1/x, Axis trans: None Response 0 pg/µl Waters Corporation 21

22 Reprodutibilidade Injeção de 200 amostras em um período de 24hr Robustness study of the Quattro Premier using verapamil in ESI +ve Peak Area CV= 3.0% Number of Injections 2012 Waters Corporation 22

23 Faixa Dinâmica Faixa de detecção entre o limite de detecção e a saturação do sinal Saturação do sinal do instrumento A ordens de magnitude (10 4 ) 100 Saturação do sinal do instrumento B 10 2 ordens de magnitude (10 2 ) 1 3 x ruído do detector (LOD) Instrumento A - faixa dinâmica de 4 ordens de magnitude (10 4 ) Instrumento B - faixa dinâmica de 2 ordens de magnitude (10 2 ) 2012 Waters Corporation 23

24 Instrumentação 2012 Waters Corporation 24

25 Espectrômetro de Massas Sistema de dados Alto vácuo mbar Sistema de inserção Fonte de íons Analisador Detector HPLC GC Bomba seringa ESI* APCI* MALDI EI CI Quadrupolo TOF Ion trap FT-ICR Setor Magnético Fotomultiplicador Multiplicador de elétrons Microchannel Plate *Fonte de íons a pressão atmosférica 2012 Waters Corporation 25

26 Instrumentação Fontes de Ionização 2012 Waters Corporation 26

27 Fonte de íons A fonte de íons gera íons em fase gasosa a partir de moléculas em fase sólida, líquida ou gasosa (dependendo da fonte). A ionização pode gerar íons positivos e/ou negativos. As formas principais de ionização são: 1) Ejeção ou captura de elétrons comum nas fontes de íons EI, CI e FI e - H 2 C CH CH 3 H 2 C CH CH 3 2) Protonação ou desprotonação comum nas fontes ESI, APCI, APPI e MALI CH 3 O CH 3 O H 2 N CH C NH CH C OH H + CH 3 O CH 3 O H 2 N CH C NH CH C OH H 2012 Waters Corporation 27

28 Ionização a pressão atmosférica - API ESI (Electrospray) APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) APPI (Atmospheric Pressure Photo Ionization) APGC (Atmospheric Pressure Gas Chromatography) ASAP (Atmospheric Pressure Solids Analysis Probe) 2012 Waters Corporation 28

29 Ionização por Electrospray kv + - High Voltage Power Supply Counter Electrode 2012 Waters Corporation 29

30 Ionização por Electrospray Líquido Mais íons negativos do que positivos Gotículas carregadas positivamente Cone de Taylor Alta voltagem Sonda de Electrospray Mais íons positivos do que negativos 2012 Waters Corporation 30

31 Rompimento das gotículas do spray em ESI Evaporação do solvente Fissão Coulombica Resíduos de carga na superfície das gotículas do spray. O solvente evapora das gotículas, que diminuem de tamanho até que a densidade de carga na superfície alcança um ponto no qual a densidade de carga excede a tensão superficial que mantém a gota estável. Neste ponto, a gotícula sofre fissão, e várias gotículas menores são formadas a partir da principal. Essas gotas menores sofrerão o mesmo processo Waters Corporation 31

32 Mecanismos de ionização em ESI 2012 Waters Corporation 32

33 Ponta da sonda de Electrospray Tubo de aço inoxidável Capilar de aço inoxidável Líquido Pluma do Electrospray 2012 Waters Corporation 33

34 Ponta da sonda de Electrospray Gás nebulisador Líquido Gás nebulisador Pluma do Electrospray 2012 Waters Corporation 34

35 Ponta da sonda de Electrospray Gás de dessolvatação Gás nebulisador Líquido Gás nebulisador Pluma do Electrospray Gás de dessolvatação 2012 Waters Corporation 35

36 Fluxo do gás de dessolvatação Nitrogênio Aquecedor Aquecedor Nitrogênio 2012 Waters Corporation 36

37 Fonte Z-Spray Aquecedor do gás de dessolvatação Sonda de Electrospray Válvula de isolamento 2012 Waters Corporation 37

38 Cone de amostra e suporte do gás do cone 2012 Waters Corporation 38

39 Fonte Z-Spray Analisador Para a bomba rotativa Lentes de RF Cone de extração Suporte do bloco Cone de amostragem Bloco de transferência de íons Válvula de isolamento Gás do cone ESI/ APcI 2012 Waters Corporation 39

40 Temperatura de dessolvatação e fluxo de gás dependem do fluxo do LC Fluxo do LC µl/min Temperatura de dessolvatação Fluxo de gás L/hr < > Waters Corporation 40

41 Íons gerados em Electrospray Íons de Electrospray positivos são produzidos pela adição de um íon positivo (e.g H+, NH4+, Na+). Íons que são formados por íons diferentes de H+ são chamados adutos. H N O Lidocaína N C H 3 CH 3 + H+ H N O + H N C H 3 Íons com carga negativa são formados pela remoção de um próton da molécula, ou por adição de íon negativo. CH 3 Ibuprofen C H 3 C H 3 C H 3 O C H 3 O + H+ H 3 C OH H 3 C O 2012 Waters Corporation 41

42 Exemplo de ESI - ß-Ciclodextrina HO O OH HO HO O OH O OH O OH O OH ß-Ciclodextrina é um anel de 7 unidades de glicose HO O OH O OH O HO O OH OH OH O HO O OH HO O HO O HO O HO OH O O OH OH 2012 Waters Corporation 42

43 Elecrospray positivo e negativo da ß-Ciclodextrina BetaCyDex_6 1 (2.186) 100 % (M-H) Quattro micro Electrospray negativo Scan ES- 8.73e6 0 BetaCyDex_5 1 (10.018) 100 % (M+H) : Scan ES+ 5.53e6 Electrospray positivo m/z 10 µg/ml de ß-Ciclodextrina em 20/80 ACN/20 mm Acetato de amônio ph 4 em água, infusão a 10 µl/min 2012 Waters Corporation 43

44 Íons com múltiplas cargas Espectro de Electrospray da Mioglobina % m/z 2012 Waters Corporation 44

45 Íons de ESI com múltiplas cargas Processo de deconvolução m 1 = M+n 1 H n 1 m 2 = M+n 2 H n n 2 n 2 = n Waters Corporation 45

46 Íons de ESI com múltiplas cargas Espectrômetros de massas separam íons de acordo com a relação massa/carga (m/z). Carga simples m/z = (M+H + ) Carga dupla m/z = 1 / 2 (M+2H + ) Carga n m/z = 1 / n (M+nH + ) Isótopos de íons de carga dupla são separados por 0.5 m/z Isótopos de íons de carga tripla são separados por 0.33 m/z 2012 Waters Corporation 46

47 Reconhecendo íons com múltiplas cargas (M+2H) Waters Corporation 47

48 Reconhecendo íons com múltiplas cargas (M+3H) Waters Corporation 48

49 Ionização por electrospray Ideal para moléculas de massas baixas até massas muito altas (50 to >500,000 Da) Pode produzir espécies multi-carregadas (principalmente para íons > 1000 Da) Ionização branda, gera pouca fragmentação Fase móvel aquosa (cromatografia de fase reversa) 2012 Waters Corporation 49

50 APCI T ~ o C Íons positivos Íons negativos Corrente na Corona µa 1-5 µa Voltagem na Corona 1-4 kv 1-4 kv 2012 Waters Corporation 50

51 Sonda de APcI Tubo de aço Capilar de sílica fundida Para inserção da amostra Aquecedor Aquecedor Agulha corona (voltagem aplicada) 2012 Waters Corporation 51

52 Sonda de APcI Aquecedor C Aquecedor vaporiza o líquido e aquece os gases Aquecedor C Gás nebulisador para formação do spray Corona Pin (Voltage Applied) 2012 Waters Corporation 52

53 Sonda de APcI Gás suporte para carregar a amostra para fora da sonda Aquecedor Aquecedor Corona 2012 Waters Corporation 53

54 Sonda de APcI Gás suporte para carregar a amostra para fora da sonda Aquecedor Aquecedor Corona 2012 Waters Corporation 54

55 Sonda de APcI Gás de dessolvatação Capilar de sílica fundida Aquecedor Descarga em plasma (Amostra vaporizada sai da sonda e é ionizada nesta região) Aquecedor Gás suporte Gás de nebulização Corona 2012 Waters Corporation 55

56 Ionização por APcI Ionização mais agressiva, com temperaturas mais altas. Moléculas de solvente transferidas a fase gasosa (nebulização). Ionização ocorre no plasma. Função do nitrogênio é evaporar o solvente expelido do capilar. Pode apresentar maior sensibilidade do que ESI para algumas moléculas não polares Waters Corporation 56

57 Mecanismo de ionização APCI (I) Transferência de carga Corona Pin e - N 2 2N 2 M 2e - N + 2 N + 4 M + M + M Condições que a fonte está seca Favorável para compostos relativamente apolares 2012 Waters Corporation 57

58 Mecanismo de Ionização APCI (II) Protonação M Corona Pin N 2 + N 4 + H 2 O H 2 O + H 3 O + +OH [M+H] + H2O Presença de água ou metanol Compostos mais polares 2012 Waters Corporation 58

59 Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APcI) Ideal para moléculas de baixo peso molecular (<1000 Da) Forma íons mono-carregados (carga +/- 1) Gera fragmentação mesmo com baixa energia do cone Fase móvel pode ser não polar (cromatografia de fase normal) 2012 Waters Corporation 59

60 APCI e ESI APcI Electrospray Ionização Processo em fase gasosa Processo em fase líquida Sonda Capilar de sílica fundida Capilar de aço inox Potencial Aplicado a agulha Corona Aplicado ao capilar Processo Aquecedor da sonda vaporiza Spray de gotículas carregadas o solvente. é produzido. Todas as moléculas transferidas a fase gasosa. Agulha corona produz íons nitrogênio. Moléculas são ionizadas ao colidirem com íons nitrogênio O solvente é evaporado das gotículas. Gotículas se dividem em gotículas menores. Quando as gotículas se tornam suficientemente pequenas, íons são transferidos à fase gasosa Waters Corporation 60

61 Ionização APPI 2012 Waters Corporation 61

62 Fonte de APPI 2012 Waters Corporation 62

63 APPI - Moleculas < 1000 Da Aplicações para APPI - Moléculas ionizáveis, de polaridade alta ou média. - Técnica sensível para compostos com alta afinidade por prótons. - Pode ionizar compostos extremamente não polares que não podem ser ionizados por APCI - Modos de ionização positivo e negativo Waters Corporation 63

64 Técnicas de Ionização 100,000 10,000 Massa molar 1,000 APPI ESI 100 EI APCI ESI, APCI, APPI 10 apolar Polaridade do analito iônico 2012 Waters Corporation 64

65 Instrumentação Ion guides 2012 Waters Corporation 65

66 Ion guides Focalização de íons Hexapolo: RF transfere os íons T-Wave 2012 Waters Corporation 66

67 StepWave Tranferência de íons Aumento da sensibilidade Minimiza ruído Extenção da tecnologia T-Wave 2012 Waters Corporation 67

68 Instrumentação Analisadores de Massas 2012 Waters Corporation 68

69 Analisador de massas O analisador de massas separa íons de acordo com a relação massa/carga (m/z) Íon com massa molar 1000 Da: Carga +1 (or -1) pico em m/z 1000 Carga +2 (or -2) pico em m/z 500 Analisadores de massas mais comuns: Tempo de Vôo (Time of Flight -ToF) Quadrupolo Ion Trap Setor Magnético Fourier Transform Ion cyclotron resonance (FT-ICR) 2012 Waters Corporation 69

70 Analisadores de massas Sistema de aquisição de dados High vacuum mbar Sistema de inserção Fonte de íons Analisador Detector Quadrupolo TOF Ion trap Setor Magnético 2012 Waters Corporation 70

71 Analisador de Massas: Quadrupolo 2012 Waters Corporation 71

72 Quadrupolo O quadrupolo funciona como um filtro de massas Íons rejeitados Íon com tragetória estável 2012 Waters Corporation 72

73 Quadrupolo 2012 Waters Corporation 73

74 Teoria do Quadrupolo O íon m tem tragetória instável se o quadrupolo opera com valores de U e V nesta região O íon m tem tragetória estável se o quadrupolo opera com valores de U e V nesta região 2012 Waters Corporation 74

75 Teoria do Quadrupolo Linha operacional do quadrupolo inadequada com tragetórias estáveis com tragetórias estáveis Apenas m3 tem tragetória estável 2012 Waters Corporation 75

76 Teoria do Quadrupolo Resolução do Quadrupolo 2012 Waters Corporation 76

77 Resolução do Quadrupolo 2012 Waters Corporation 77

78 Resolução do Quadrupolo Resolução unitária 2012 Waters Corporation 78

79 Ion trap A voltagem RF é aplicada ao eletrodo anel (ring electrode) para confinar (trap) os íons. Detection End Cap Damping gas (Hélio %) é necessário para reduzir a energia dos íons através de colisões, reduzindo as oscilações até que eles estabilizem próximos ao centro do eletrodo, onde os campos de confinamento estão próximos do ideal (menos distorcidos), apresentando melhor resolução e sensibilidade. End Cap Ion Injection Ring Electrode 2012 Waters Corporation 79

80 Componentes do Ion Trap End Caps Ion trap montado Ring 2012 Waters Corporation 80

81 Ion Trap - MS n Variando a voltagem RF no eletrodo, é feita a varredura de massas. MS/MS é possível selecionando um íon no trap, fragmentando-o por colisões com He, e então fazendo a varredura para detecção dos fragmentos. É possível fazer vários estágios de fragmentação (MS n ). End Cap Detection Ring Electrode End Cap Ion Injection 2012 Waters Corporation 81

82 Ion Trap 2012 Waters Corporation 82

83 Analisador do Tempo de Voo Laser Detector m/z > m/z Processamento do sinal 2012 Waters Corporation 83

84 Laser Detector m/z > m/z Processamento do sinal 2012 Waters Corporation 84

85 Teoria do Tempo de Vôo Aceleração Detector m/z = t 2 (2Ve/d 2 ) Sinal do detector 0 Tempo ápós aceleração 2012 Waters Corporation 85

86 Analisador do Tempo de Voo Laser Detector m/z > m/z Processamento do sinal 2012 Waters Corporation 86

87 Analisador do Tempo de Voo Laser Detector m/z > m/z Processamento do sinal Espectro 2012 Waters Corporation 87

88 Analisador do Tempo de Voo Detector m/z > m/z Processamento do sinal 2012 Waters Corporation 88

89 TOF Reflectron Laser Reflectron Detector 2012 Waters Corporation 89

90 Resolução do TOF R = m/ m ToF Linear ToF Reflectron FWHM (Full Width Half Medium) R = m / largura do pico a meia altura = 1000/0.1 = 10, Waters Corporation 90

91 Espectro de Maldi TOF Linear 5 pmol IgG (SA) with high mass detector 0;G3 28-Apr x10 Íons de alta massa molar monocarregados % m/z 2012 Waters Corporation 91

92 Instrumentação Detectores 2012 Waters Corporation 92

93 Analisadores de massas Sistema de aquisição de dados High vacuum mbar Sistema de inserção Fonte de íons Analisador Detector Fotomultiplicador Multiplicador de elétrons Microchannel Plate 2012 Waters Corporation 93

94 Detectores O detector tem a função de detectar e amplificar o sinal da corrente de íons que vem do analisador e transferir o sinal para o sistema de processamento de dados. Os três tipos principais de detectores são: fotomultiplicador multiplicador de elétrons microchannel plate (MCP) O detector depende do tipo de analisador: Fotomultiplicador e multiplicador de elétrons são utilizados com analisadores quadrupolo, setor magnético e ion trap e apresentam larga faixa dinâmica ( ) MCP é utilizado com analisadores TOF e apresentam resposta extremamente rápida, com alta sensibilidade Waters Corporation 94

95 Multiplicadora de elétrons Um dinodo de conversão é utilizado para converter A conversion dynode is used to convert either negative or íons positivos ou negativos em elétrons. Potenciais positive ions into electrons. Higher potentials on the mais altos nos dinodos de conversão são utilizados para conversion acelerar dynodes íons are de used massas to accelerate altas e assim high mass melhorar ions a and sensibilidade. thereby enhance sensitivity. Mass Analyser Conversion Dynode (Voltage 1-20 kv) Electron Multiplier (voltage setting lower than Dynode) Current is measured 2012 Waters Corporation 95

96 Fotomultiplicadora Dinodo High voltage de conversão conversion dynode de alta (converts voltagem either positive converte or íons negative positivos ions into ouelectrons) negativos em elétrons, que são em seguida convertidos em luz (fótons). Electrons impinge onto light emmitting phosphor that is optically coupled to a photomultiplier O Fotomultiplicador é selado em um envelope de vidro, Photomultiplier e assim permanently é protegido sealed de contaminação, its own glass o que faz com que seu tempo de vida seja mais longo. envelope. The detector is protected from contamination and thus longer lifetimes are achieved. Um fotomultiplicador tem um tempo de vida estimado de 10 anos sem manutenção The photomultiplier has a 10 year maintenance-free lifetime. dynode phosphor photomultiplier 2012 Waters Corporation 96

97 Fotomultiplicador Detecção de íons positivos X+ X + X + X + X + X + X+ Dinodo de conversão -20 kv Feixe de íons Eletrons e - e - e - e - e - Dinodo de conversão +10 kv Disco Phosphor +20 kv Fótons 2012 Waters Corporation 97

98 X - X - X - X - X - X - X - Fotomultiplicador Detecção de íons negativos Dinodo de conversão -20 kv X - X - e - e - X - e - Dinodo de conversão +10 kv e - e Waters Corporation 98

99 Microchannel plate A maioria dos espectrômetros TOF utilizam o detector multichannel plate (mcp), que apresenta tempo de resposta < 1 ns e alta sensibilidade (sinal de um único íon > 50 mv). Apenas alguns poucos das centenas de canais do MCP são afetados pela detecção de um íon, e assim é possível a detecção de muitos íons ao mesmo tempo, o que é importante para MALDI, onde centenas de íons podem ser gerados em alguns nanosegundos Waters Corporation 99

100 QToF Premier MicroChannel Plates (MCPs) MCPs in situ Placa de MCP O MCP é um multiplicador de elétrons muito rápido, no qual um único íon pode resultar em 1x10 7 electrons sendo produzidos em um período de 4-5 ns Waters Corporation 100

101 Novos detectores Multiplicador de electrons ultra-rápido + eletrônica ADC 2012 Waters Corporation 101

102 Espectrometria de Massas Sequencial 2012 Waters Corporation 102

103 Espectrometria de Massas Sequencial A r g o n Fonte de íons 1º analisador Seleção do íon precursor Câmara de colisão Detector 2º analisador Seleção de fragmentos Quadrupolo Quadrupolo ou TOF 2012 Waters Corporation 103

104 Câmara de colisão para MS/MS Hexapolo Feixe de íons Aceleração de íons na entrada e saída 2012 Waters Corporation 104

105 Tecnologia T-Wave ions time Collision Cell Aquisições de MRM rápidas 100 pontos/segundo Mantém sensibilidade Minimiza contaminação cruzada Travelling Wave Pulse 2012 Waters Corporation 105

106 Tecnologia ScanWave Collision Cell 2012 Waters Corporation 106

107 TriWave Aumento capacidade identificação Menores LOQs Espectros mais limpos 2012 Waters Corporation 107

108 Efeito da alteração na energia de colisão Espectro de MS/MS da Clorfeniramina (MW=274) Íons fragmento de m/z= % Energia de colisão = 5 ev M+H % Energia de colisão = 10 ev % Energia de colisão = 12 ev % Energia de colisão = 17 ev m/z 2012 Waters Corporation 108

109 Efeito da alteração na energia de colisão (Cont.) 100 % Espectro de MS/MS da Clorfeniramina (MW=274) Íons fragmento de m/z= Energia de colisão = 17 ev M+H % Energia de colisão = 30 ev % 167 Energia de colisão = 38 ev m/z 2012 Waters Corporation 109

110 Exemplo de MS/MS - Propanolol Espectro de MS/MS do Propanolol (MW=259) Íons fragmento de m/z= e7 183 M+H % m/z Espectros de MS/MS podem ser bastante complexos 2012 Waters Corporation 110

111 Exemplo de Espectros de MS/MS de um íon precursor com carga dupla [Glu1]-Fibrinopeptide B Glu-Gly-Val-Asn-Asp-Asn-Glu-Glu-Gly-Phe-Phe-Ser-Ala-Arg 100 (M+2H) MS Scan x100 Magnfied by e7 % (M+H) GluFib_Dau 1 (3.370) Sm (SG, 2x0.50) MS/MS Scan 2.89e6 % m/z 2012 Waters Corporation 111

112 Fragmentação na fonte API Fragmentação induzida pela voltagem do cone Íons produzidos por ESI ou APcI N N 2 N2 Fragmentos gerados por colisão e íons não fragmentados Voltagem do cone elevada Íons que são acelerados pela voltagem do cone colidem com moléculas de nitrogênio 2012 Waters Corporation 112

113 Exemplo de fragmentação induzida pela voltagem do cone 733 Da H 157 Da Fragmentação da Eritromicina induzida pela voltagem do cone H 575 Da 2012 Waters Corporation 113

114 MS/MS Quadrupolo Tandem Espectro de íons produto (ou fragmentos, ou de íons filhos) MS1 Câmara de colisão MS2 Estático CID Varredura MS/MS : Identificação de substâncias desconhecidas 2012 Waters Corporation 114

115 MS/MS Quadrupolo Tandem Espectro de íons produto 2012 Waters Corporation 115

116 MS/MS Quadrupolo Tandem Espectro de íons precursores MS1 Câmara de Colisão MS2 Varredura CID Estático MS/MS : Estrutural, classes de substâncias 2012 Waters Corporation 116

117 MS/MS Quadrupolo Tandem Espectro de íons precursores 2012 Waters Corporation 117

118 MS/MS Quadrupolo Tandem Espectro de perdas neutras Collision MS1 Cell MS2 Scanning CID Scanning MS/MS : Estrutural, classes de substâncias 2012 Waters Corporation 118

119 MS/MS Quadrupolo Tandem 2012 Waters Corporation 119

120 MS/MS Quadrupolo Tandem Monitoramento de reações Múltiplas - Multiple Reaction Monitoring (MRM) MS1 Collision Cell MS2 Static CID Static MS/MS : Análise de compostos alvo 2012 Waters Corporation 120

121 MS/MS Quadrupolo Tandem 2012 Waters Corporation 121

122 Survey Scan: Cromatogramas MS/MS chromatogram MS chromatogram 2012 Waters Corporation 122

123 Survey Scan : Espectro de MS/MS Peak at 7.7 min Peak at 7.1 min Peak at 4.7 min 2012 Waters Corporation 123

124 Survey Scan : Espectro de MS/MS Peak at 7.1 min Peak at 7.7 min Peak at 4.7 min 2012 Waters Corporation 124

125 MS/MS Quadrupolo-TOF (QTof) 2012 Waters Corporation 125

126 Massa exata em MS/MS 2012 Waters Corporation 126

127 Configurações de equipamentos Inserção Fonte de íons Analisador Detector HPLC ESI APCI APPI Quadrupole/TOF Ion Trap/FTICR Ion Trap/TOF MCP MALDI TOF/TOF GC EI/CI Magnetic Sector Quadrupole TOF Eletron Multiplier Photomultiplier Ion Trap 2012 Waters Corporation 127

128 Acoplamento LC - MSMS 2012 Waters Corporation 128

129 LC/MS Detector UV (Opcional) Divisor de fluxo?? (Splitter) Sistema de cromatografia líquida Coluna analítica MS Sonda Descarte O Fluxo de solvente determina se um divisor de fluxo é necessário Waters Corporation 129

130 LC/MS(MS) analysis LC/MS System (Single quadrupole) Full Scan LC/MS Single Ion Recording (SIR) LC/MS (TOF) Full Scan LC/MS LC/MS/MS (ion trap) Full Scan LC/MS Fragment (daughter) ion monitoring Single Ion Recording (SIR) Survey Scan (MS and MS/MS) 2012 Waters Corporation 130

131 LC/MS(MS) analysis LC/MS/MS System (Q-TOF) Full Scan LC/MS Product ion scan DDA (MS and MS/MS) LC/MS/MS System (Quadrupole Tandem) Full Scan LC/MS Fragment (daughter) ion monitoring Precursor (parent) ion monitoring Neutral loss monitoring Neutral gain monitoring Single Ion Recording (SIR) Multiple Reaction Monitoring (MRM) Survey Scan (MS and MS/MS) 2012 Waters Corporation 131

132 Cromatogramas de SIR and MRM 15pg/ml std ASSAY09 Sm (Mn, 2x2) 100 MRM of 3 Channels AP > 3.02e >58 % 15pg/ml std ASSAY09 Sm (Mn, 2x2) TIC MRM of 3 Channels AP+ TIC 3.76e4 0 Time pg/ml std ASSAY09 Sm (Mn, 2x2) MRM of 3 Channels AP > e >182.1 % % TIC (Total ion chromatogram) = Soma do sinal das transições individuais Time 0 Time pg/ml std ASSAY09 Sm (Mn, 2x2) MRM of 3 Channels AP > e3 % 294.1> Time 2012 Waters Corporation 132

133 Integração dos picos Após a integração do pico, a resposta é apresentada como área ou altura do pico (geralmente área). No método de calibração externa: Resposta = Area analito No método de calibração interna: Resposta = Area analito Area padrão interno 2012 Waters Corporation 133

134 HPLC x UPLC Equação de van Deemter 2012 Waters Corporation 134

135 Benefícios da Redução do Tamanho da Partícula 5 µm 150 mm L/d p = Injeção = 5,0 µl Fluxo= 0,2 ml/min Rs (2,3) = 2,28 HPLC 3,5 µm 100 mm L/d p = Injeção = 3,3 µl Fluxo= 0,3 ml/min Rs (2,3) = 2,32 2,5 µm 75 mm L/d p = Injeção = 2,5 µl Fluxo = 0,5 ml/min Rs (2,3) = 2,34 UPLC TM 1,7 µm 50 mm L/dp = Injeção = 1,7 µl Fluxo = 0,6 ml/min Rs (2,3) = 2, Waters Corporation 135

136 Benefícios da Redução do Tamanho da Partícula 0.08 AU HPLC Gradiente 5 µm Picos = 70 P c = AU UPLC Gradiente 1,7 µm Picos = 168 P c = Aumento de 2,5x Minutes Mais informação no mesmo tempo de análise 2012 Waters Corporation 136

137 Trasnferência de Métodos HPLC x UPLC 2012 Waters Corporation 137

138 Colunas de UPLC 2012 Waters Corporation 138

139 Benefícios da Utilização de UPLC Aumento da resulção na análise de amostras complexas; Diminuição da supressão de ionização causada por espécies que coeluem com o analito de interesse, acarretando em aumento de sensibilidade em métodos quantitativos; Diminuição do tempo de análise sem comprometimento de resolução cromatográfica; Diminuição da largura do pico cromatográfico, concentrando mais o analito de interesse ao entrar na interface com o MS, aumentando a sensibilidade do método Waters Corporation 139

140 Fatores a serem considerados no desenvolvimento de um método de LC/MS 1. Modo de ionização. 2. Coluna. 1. Diâmetro e fluxo de solvente 2. Tubulação 3. Fase móvel. Pode afetar tanto a cromatografia quanto no processo de ionização Waters Corporation 140

141 1. Modo de ionização: Fluxo do LC no MS ESI : µl/min em análises de rotina - É possível fluxo de até 1 ml/min para as novas fontes de ionização. Anteriormente era utilizado um divisor de fluxo para reduzir o fluxo para aproximadamente 250 µl/min na sonda de ESI. APCI : ml/min Não é necessário redução do fluxo do LC (splitter). Verificar estabilidade da amostra! 2012 Waters Corporation 141

142 2. Seleção de colunas Existe uma grande variedade de colunas de vários fornecedores. Os principais fatores a considerar são: - Separação entre analitos e de outros compostos interferentes na matriz. - Resolução dos picos Material da fase estacionária da coluna 2012 Waters Corporation 142

143 Partículas da fase estacionária Tamanho do poro: Å e 300 Å 2012 Waters Corporation 143

144 Seleção de coluna A fase móvel deve ser compatível com a coluna. Por exemplo: Muitos tipos de colunas de fase reversa irão degradar rapidamente se for utilizada fase móvel com o ph alto (básico). Colunas HILIC utilizam gradientes onde a composição da fase móvel varia de baixa proporção de água para alta proporção de água (ao contrario dos gradientes de fase reversa). A proporção de água da fase móvel raramente vai acima de 60% Waters Corporation 144

145 Tubulação de PEEK Ainda não existe convenção oficial para a coloração da tubulação de Peek, mas geralmente as cores utilizadas são: Cor Bege (Natural) Preto Vermelho Amarelo Azul Laranja ID (in.) Fluxo típico Infusão 0.1 a 0.6 ml/min 0.3 a 1 ml/min 0.7 a 2 ml/min 1 a 5 ml/min Linhas de descarte 2012 Waters Corporation 145

146 3. Fase móvel ph Solventes e aditivos Composição é muitas vezes uma opção entre o que apresenta melhor ionização e o que dá a melhor separação em LC Waters Corporation 146

147 Solventes e aditivos geralmente utilizados Solventes Água Acetonitrila Metanol Isopropanol Aditivos Ácido acético Ácido fórmico Hidróxido de amônio Acetato de amônio* Formiato de amônio* * Podem ser utilizados como tampão. Concentração de sais deve ser mantida abaixo de 10 mm Waters Corporation 147

148 Efeito da fase móvel: Cetoprofeno ACN 18.1 MeOH 12.7 ACN / Ácido fórmico 39.6 MeOH / Ácido fórmico ACN / NH 4 OH 37.9 % 0 MeOH / NH 4 OH Gradiente = 5% B em 0 min; 90% B em 8.5 min; 90% B em 8.5 até 11 min; Concentração de aditivos orgânicos: Ácido fórmico = 0.05%; NH 4 OH = 2.9 mm (0.02%) Time 2012 Waters Corporation 148

149 Outros solventes e aditivos IPA, etanol, 2-metoxietanol, etc. Ácido trifluoroacético (TFA) - Proteinas e Peptídeos Trietilamina (TEA) Pode melhorar ionização no modo negativo Tetrahidrofurano (THF) Cromatografia de fase normal Solventes para limpeza de colunas somente (CH 2 Cl 2, Acetona) 2012 Waters Corporation 149

150 Solventes e aditivos que devem ser utilizados com cuidado TFA Utilizado na análise de proteínas e peptídeos Causa supressão de íons em electrospray positivo quando em concentrações acima de 0.1%. Causa forte supressão de íons em ESI negativo. TEA Pode melhorar o sinal em ESI negativo de compostos pouco básicos. Facilmente ionizado, gerando um sinal intenso (M + H) + em m/z 102. Suprime o sinal em ESI positivo para compostos pouco básicos. THF 100% THF é altamente inflamável. Não deve ser utilizado com APCI se ar for utilizado como gás nebulizador Waters Corporation 150

151 Efeito do ácido fórmico e TFA 100 Sem Aditivos Apenas água e ACN % e6 Exemplo: Cetoéster Electrospray positivo Cromatograma extraído do íon m/z = 365 a partir de dados de MS em Full Scan. Fase móvel = 30/70 Água/ACN Time Considerando a ionização por ESI Positivo, abaixar o ph pode ajudar 2012 Waters Corporation 151

152 Efeito do ácido fórmico e TFA 100 Sem Aditivos Apenas água e Acn e e6 0.03% Ácido fórmico A adição de ácido fórmico à fase móvel reduziu o ph da fase móvel e aumentou o sinal [M+H + ] em ESI positivo. % 7.56 % Time Time 2012 Waters Corporation 152

153 Efeito do ácido fórmico e TFA Raylo_1_004 Sm (Mn, 2x3) 100 F e e e6 Sem Aditivos Apenas água e Acn 0.03% Ácido fórmico 0.03% TFA % 7.56 % % Time Time Time 2012 Waters Corporation 153

154 Solventes e tampões que não devem ser utilizados Sais não voláteis (fosfatos, boratos, citratos, etc.) Detergentes (suprimem ionização) Ácidos inorgânicos (ácido sulfúrico, ácido fosfórico, etc.) Solventes que não devem ser utilizados com tubulação de PEEK Atacam PEEK HNO 3 concentrado H 2 SO 4 concentrado Incham PEEK DMSO THF CH 2 Cl Waters Corporation 154

155 Divisor de fluxo Tubulação PEEK Splitter de volume morto zero Coluna analítica Sonda de Electrospray Para reduzir o fluxo para o MS podemos: Reduzir o tamanho da tubulação de descarte. Aumentar o diâmetro da tubulação de descarte. Tubulação de PEEK Descarte, DAD ou Coletor de frações 2012 Waters Corporation 155

156 Splitting Pós-Coluna O sinal em ESI é dependente da concentração do analito na solução. Isso permite que seja feita a divisão do fluxo sem redução na intensidade do sinal. 0.1 ml/min 1.0 ml/min 0.9 ml/min As vantagens do divisão do fluxo são: Reduz a necessidade de limpeza na fonte Otimiza as condições de fluxo Waters Corporation 156

157 Efeito do fluxo de solvente no sinal em Electrospray (Análise em MRM de dois compostos) FlowSplitTest_Split 100 Fluxo do LC = 0.6 ml/min Split 1:2 (0.3 ml/min to MS) 5.72 F > e3 Fluxo do LC = 0.6 ml/min Sem Split (0.6 ml/min to MS) FlowSplitTest_NoSplit F > e3 % % 0 FlowSplitTest_Split F > e4 0 FlowSplitTest_NoSplit F > e4 % % 0 Time 0 Time Waters Corporation 157

158 Gradientes de fase móvel em LC Gradientes de fase móvel podem ser utilizados para separar analitos de componentes interferentes da matriz, que podem causar supressão de íons. O sistema de LC é configurado com fases móveis orgânica e aquosa. A porcentagem do solvente orgânico na fase móvel é aumentado gradativamente durante a corrida (em fase reversa). Gradientes são utilizados para melhorar a separação e reduzir o tempo de análise e preparação de amostra em LC Waters Corporation 158

159 Gradientes de fase móvel em LC Geralmente, um gradiente tem 3 fases. 1) Início da corrida: Fase móvel tem uma baixa proporção de solvente orgânico. Os analitos são retidos na coluna e os sais são eluídos da coluna. 2) Meio da corrida: A composição da fase móvel é alterada gradativamente de baixa proporção de solvente orgânico para alta proporção de solvente orgânico. Neste tempo, os analitos eluem da coluna e são transferidos ao MS onde são analisados. 3) Final da corrida: Fase móvel com alta proporção de solvente orgânico, que lava a coluna eliminando componentes hidrofóbicos da matriz que permaneceram na coluna Waters Corporation 159

160 Gradientes de fase móvel em LC Analitos retidos na coluna, sais passam pela coluna e são eliminados. 100 % Percentual orgânico na fase móvel Analitos eluem da coluna Componentes hidrofóbicos da matriz são eluídos da coluna. Coluna é equilibrada para a próxima corrida 0 % Tempo 2012 Waters Corporation 160

161 Gradientes de fase móvel 100 % Percentual orgânico na fase móvel 0 % t Tempo Se os analitos de interesse eluem da coluna no tempo t, então a porcentagem do componente orgânico pode aumentar rapidamente após o tempo t para reduzir o tempo de análise Waters Corporation 161

162 Exemplo de valvula de desvio de fluxo Descarte Coluna analítica Descarte Coluna analítica 1 6 LC-AS 1 6 LC-AS 5 5 MS LC-AS = LC Autosampler MS Load Position Inject Position No método de MS, programar o solvent delay para o período de tempo que a válvula será mantida na posição Load Waters Corporation 162

163 Considerações da preparação da amostra para LC/MS Em alguns casos pode ser necessário limpar as amostras antes da análise Componentes interferentes na amostra podem entupir a coluna ou então eluir no mesmo tempo que os analitos, o que pode ocasionar em supressão de íons. Extração líquido-líquido, SPE, ou outros métodos de limpeza de amostra podem ser necessários. Derivatização pode ser necessária. Filtros e pré-colunas podem ajudar Waters Corporation 163

164 Efeito da solução da amostra na cromatografia Solução da amostra utilizada Ácida Variação do ph Básica Purge_Soln_5_Acidic 100 % 0 Purge_Soln_4_Neutral 100 % 0.1% Ácido fórmico Água/MeOH (Sem aditivos) 0 Purge_Soln_3_WeakBase 100 % 1 Purge_Soln_2_Base 100 % 2 Purge_Soln_1_StrongBase 100 % 0.01% NH 4 OH & 2 mm de acetato de amônio 0.1% NH4OH & 2 mm de acetato de amônio 0.2% NH4OH & 2 mm de acetato de amônio 4.22 MRM of 1 Channel ES TIC 1.97e4 MRM of 5 Channels ES TIC 8.61e4 MRM of 1 Channel ES+ TIC 2.43e Ótimo formato de pico, mas com muito carryover 2012 Waters Corporation MRM of 1 Channel ES+ TIC 2.01e4 MRM of 1 Channel ES+ TIC 2.25e4 Time Bom formato de pico com pouco carryover Divide o pico

165 O que é Efeito Matriz (EM)? Alteração (aumento/diminuição) na resposta do analito quando analisado em solução e em na matriz de interesse; Alteração se dá em função da natureza competitiva do processo de ionização em MS; Comumente observado em matrizes complexas: plasma, urina, extratos vegetais, resíduos de animais e vegetais Waters Corporation 165

166 Quais as consequências do EM? Baixa exatidão; Baixa reprodutibilidade; Diminuição da linearidade; Alteração no tempo de retenção; Imprevisibilidade: pode causar diminuição/aumento do sinal dentro do mesmo lote de amostras Waters Corporation 166

167 Quais as consequências do EM? 2012 Waters Corporation 167

168 Quais as consequências do EM? 2012 Waters Corporation 168

169 Quais as consequências do EM? 2012 Waters Corporation 169

170 Quais as consequências do EM? 2012 Waters Corporation 170

171 Fatores que afetam a formação de íons em ESI Variáveis do Sistema: Campo elétrico; Diâmetro do capilar; Voltagem do capilar. Variáveis do Composto: Atividade superficial; Afinidade por prótons; Energia de solvatação. Variáveis do Método: Fluxo de fase móvel; Concentração de eletrólitos; ph Waters Corporation 171

172 O que pode dar errado no processo? Ficar em solução Transferência de cargas Formação de cluster com solventes O que pode dar errado? Precipitar como sólido neutro Precipitar como composto de inclusão Transferência para fase gasosa como neutro 2012 Waters Corporation 172

173 Como monitorar o EM? I Método de Infusão Pós-Coluna Injeção de Branco e Matriz Extraída Infusão Constante do Padrão Informação Qualitativa do EM 2012 Waters Corporation 173

174 Como monitorar o EM? I Método de Infusão Pós-Coluna Infusão em Solvente 2012 Waters Corporation 174

175 Como monitorar o EM? I Método de Infusão Pós-Coluna Infusão em Matriz Extraída Dependente do composto Dependente da matriz 2012 Waters Corporation 175

176 Como prevenir supressão de íons Curva de calibração feita na matriz Padrões internos análogos Marcados isotopicamente ( 13 C, D, 15 N, 18 O, etc) Melhorar a limpeza da amostra (clean up). Usar cromatografia para separar componentes que co-eluem: UPLC apresenta melhor resolução, ou seja picos mais separados, reduzindo o efeito de matriz Waters Corporation 176

177 Efeitos de matriz Quantificação dos efeitos de matriz Branco de matriz (sem analitos) Solução de padrões em solvente (sem matriz) Resposta Efeito de matriz % = ( Analitos adicionados após extração - 1) x 100 Resposta Solução de padrões em solvente Padrões adicionados na matriz extraída - As duas amostras devem estar na mesma solução - Valor negativo = supressão - Valor positivo = acréscimo 2012 Waters Corporation 177

178 Recuperação Branco de matriz (sem analitos) Adição de padrões no branco de matriz Recuperação do procedimento de extração: Adição de padrões na matriz extraída % RE = 100 x Resposta analitos adicionados antes da extração Resposta analitos adicionados após a extração ( ) 2012 Waters Corporation 178

179 Desenvolvimento de Métodos Quantitativos por LC MS e LC - MSMS 2012 Waters Corporation 179

180 MS/MS com Quadrupolo Tandem Single Ion Recording (SIR) MS1 Estático MS : Análise de compostos alvo 2012 Waters Corporation 180

181 MS/MS com Quadrupolo Tandem Multiple Reaction Monitoring (MRM) MS1 Câmara de Colisão MS2 Estático CID Estático MS/MS : Análise de compostos alvo 2012 Waters Corporation 181

182 MS/MS com Quadrupolo Tandem 2012 Waters Corporation 182

183 MRM e SIR em matrizes complexas MRM SIR 2012 Waters Corporation 183

184 Etapas do desenvolvimento de método de LC/MS Experimentos de infusão para definir o método de ionização e otimizar as condições de MS para a sensibilidade e seletividade necessária. Otimização de valores da energia do cone para cada íon precursor Experimentos de MS/MS para determinação dos fragmentos a serem monitorados em MRM e otimização da energia de colisão para cada transição. TIBFS1 100 % MS2 AP+ TIC 2.92e Desenvolvimanto do método de LC Time Otimização das etapas de extração e preparação da amostra. Estudos de recuperação e efeito de matriz. acq11mix6 100 Peak at 1.41 min 1.5 sec at baseline 10000da/sec 23 scans across peak % Ephedrine 0.58 Caffeine Doxylamine Lidocaine 0.74 Propranolol Diphenhydramine Trimipramine Oxybutynin : Scan ES+ BPI 1.31e Criação do método para processamento de dados e quantificação. Time Waters Corporation Terfenadine 1.41

185 Transições em MRM Transições de MRM são escolhidas por: - Intensidade do íon fragmento - Seletividade do íon fragmento 2012 Waters Corporation 185

186 Métodos de MRM e SIR Método SIR Método MRM 2012 Waters Corporation 186

187 Transições de confirmação em MRM Alguns métodos (ex: análise de pesticidas) necessitam mais de uma transição por composto analisado. Neste caso, a transição principal é chamada de transição de quantificação, enquanto que as demais (geralmente 1 a 3) são chamadas transições de confirmação. 080_METHAMIDOPHOS 41 (0.752) Daughters of 142ES+ 6.37e5 Quantificação 125 Confirmação 1 % Confirmação m/z 2012 Waters Corporation 187

188 Transições de confirmação em MRM Não apenas a presença das transições de confirmação, mas também a relação da área dos picos de quantificação/confirmação podem ser utilizadas para confirmar a presença de uma substância. 12March_01 Smooth(SG,1x2) 50 pg/ul Solvent Standard, 100 % F1:MRM of 3 channels,es+ 142 > 93.9 Methamidophos 9.889e Quantificação -0 12March_01 Smooth(SG,1x2) 50 pg/ul Solvent Standard, 100 % Methamidophos Confirmação 1 min F1:MRM of 3 channels,es+ 142 > e March_01 Smooth(SG,1x2) 50 pg/ul Solvent Standard, 100 % Methamidophos min F1:MRM of 3 channels,es+ 142 > e+004 Confirmação min 2012 Waters Corporation 188

189 UPLC partículas de 1.7µm Separações mais rápidas 2-5x Maior resolução Separação de metabólitos Redução nos efeitos de matriz Maior sensibilidade LOQ 3x mais baixo 2012 Waters Corporation 189

190 UPLC - MSMS x HPLC - MSMS QM_HPLC_ESI+_4Compound_041205_010 ESI+, Alprazolam MRM of 4 Channels ES+ 309 > e5 Height % HPLC-MS/MS QM_UPLC_ESI+_2Compound_042605_010 MRM of 2 Channels ES > e5 Height % UPLC-MS/MS 0 Time Aumento de 3,7 vezes na altura do pico. Relação sinal-ruído de 4.7 vezes Waters Corporation 190

191 Compatibilidade com UPLC: Velocidade de aquisição em MRM O ciclo de tempo por transição de MRM é composto por dois parâmetros: Período em que os íons serão monitorados (dwell time) Período entre a aquisição de duas transições sucessivas de MRM necessário para eliminar os íons da transição anterior da câmara de colisão (inter-channel delay). Para reduzir o ciclo de tempo, deve-se reduzir o tempo dos íons na câmara de colisão, porém com precaução Waters Corporation 191

192 Modos de aquisição Métodos de varredura: Full Scan, Daughter, Parent scan: Full scan m/z em 1 segundo, Inter scan delay* = segundos por ponto cromatográfico Métodos estáticos: MRM ou SIR Exemplo: 3 transições, Dwell time = 0.05 s, Inter channel delay* = segundo por ponto cromatográfico *Inter-channel delay: Tempo para limpar os quadrupolos e a câmara de colisão dos íons da aquisição anterior Waters Corporation 192

193 Dwell time Dwell time tempo de aquisição (em segundos) para o monitoramento de cada transição (MRM) íon (SIR). O objetivo da otimização do dwell time é a obtenção de um pico cromatográfico com pelo menos 13 pontos para garantir um formato de pico adequado para a integração e quantificação. O dwell time ideal é determinado considerando-se a largura do pico cromatográfico na base e o número de transições monitoradas. Exemplo: Largura do pico = 30 segundos (s) Número de transições = 7 30 s/13 pontos = 2.3 s por ponto 2.3 s/7 transições = 0.32 s por transição Inter-channel delay ~0.02 s Melhor dwell time = 0.30 s 2012 Waters Corporation 193

194 Dwell time Efeito do dwell time sobre a relação sinal-ruído: O dwell time ideal é o tempo mais longo que ainda permita a obtenção do número de pontos cromatográficos suficientes (13 pontos por pico) 2012 Waters Corporation 194

195 Velocidade de aquisição em MRM Câmara de colisão tradicional ( multipolo ) Efeito do tempo de aquisição na intensidade do sinal 2012 Waters Corporation 195

196 Velocidade de aquisição em MRM Câmara de colisão T-Wave Efeito do tempo de aquisição na intensidade do sinal 100 pontos de aquisição por segundo 2012 Waters Corporation 196

197 Sintomas dwell time inadequado Problemas com reprodutibilidade entre injeções Queda de sensibilidade Formato de pico não ideal Problemas com linearidade 2012 Waters Corporation 197

198 Considerações importantes Largura do pico cromatográfico Numero de compostos analisados Os parâmetros acima afetam diretamente o número de pontos atravéz do pico Waters Corporation 198

199 Parametros que influenciam o número de pontos em um pico A soma destes parâmetros em cada função resulta no tempo de cada ciclo Waters Corporation 199

200 Pontos de aquisição? A relação entre o tempo do ciclo e a largura de pico é extremamente importante. Um ciclo de aquisição 2012 Waters Corporation 200

201 Cálculo do tempo do ciclo Tempo do ciclo Dwell time Inter-channel delay Inter-scan delay Tempo 2012 Waters Corporation 201

202 Cálculo do tempo do ciclo Uma função contendo 10 transições de MRM Tempos Individuais o Dwell time 50ms (0.05 s) o Inter-channel delay 5ms (0.005 s) o Inter-scan delay 10ms (0.01 s) Tempo Total do ciclo o (0.05 x 10) o (0.005 x 9) o 0.01 = 0.55 s 9 pontos em um pico cromatográfico de 5 s 2012 Waters Corporation 202

203 Compatibilidade com UPLC: Picos mais estreitos = menos pontos de dados? 100 ms Dwell Time, 10 ms Delay 0.63 Convert the x axis to scan number 0.63 Peak Width = 1.8 s Points Across Peak = 7 % % 0 0 Time Scan ms Dwell Time, 5 ms Delay % 0.63 Convert the x axis to scan number % 0.63 Peak Width 1.8 s Points Across Peak = Time Scan 2012 Waters Corporation 203

204 Screening com Tof 2012 Waters Corporation 204

205 Análises Focadas Quadrupolos Tandem Vantagens Desvantagens Alta sensibilidade MRM em QqQ Alta seletividade Desde que as transições escolhidas sejam específicas Alta faixa dinâmica Conforme legislação em vigor Monitoramento de transições de quantificação e confirmação Necessidade de otimização individual dos analitos Necessidade dos padrões individuais Sensibilidade dependente do número de analitos Duty cycle vs. número de transições Incapacidade de reinterpretar dados obtidos anteriormente Em caso de necessidade de novos analitos, é necessário a reanálise 2012 Waters Corporation 205

206 Screening com Tof Qual o objetivo? Identificação Análise de universal, compostos nãofocada desconhecidos Possível Aumento mesmo no quenúmero na ausência de compostos de padrões Metabólitos, Maximizar informação produtos de em degradação uma única análise Reanálise de dados Reinjeções obtidos desnecessárias anteriormente 2012 Waters Corporation 206

207 Como funciona um Tof/Qtof? 2012 Waters Corporation 207

208 Massa Exata = Confiança XX Nominal mass, quadrupole or ion trap Exact mass C33H41N C34H41010 C29H33N14S C34H37N605 C31H41N605S C27H37N1203S C38H Waters Corporation C28H37N1004S C34H37N100S 208

209 Necessidades de Tofs para Anállise de Resíduos Estabilidade na Exatidão de Massas XIC estreitos Redução de falsos positivos Sensibilidade Atingir limites regulatórios Descoberta de novos contaminantes Aumento na confiabilidade, redução de falsos positivos Velocidade Uma única injeção para análises quali e quantitativas Resolução Cromatográfica e MS Seletividade nos íons fragmentos 2012 Waters Corporation 209

210 Sistema de Detecção de Íons Detectores Convencionais MCP Convencional Detector do Tof 2012 Waters Corporation 210

211 Sistema de Detecção de Íons Detectores Convencionais 2012 Waters Corporation 211

212 Sistema de Detecção de Íons Novo ADC Híbrido Waters MCP Convencional Detector do Tof Novo ADC Híbrido Detector do Tof 2012 Waters Corporation 212

213 ADC Híbrido: Melhor dos Mundos! 2012 Waters Corporation 213

214 Redução de Falsos Positivos Tiabendazol 20 ppb em feijões verdes Scan No. Measured Mass M (mda) M (ppm) RMS = % m/z Waters Corporation 214

215 Screening com Tof Janelas de XIC Estreitas 100 % 100 mda % 2.03 XIC fragmento m/z % 100 % mda mda % 100 % 100 % 3 mda mda mda Tim e MS E = Alta seletividade para precursores e fragmentos % % XIC precursor m/z TIC Tiabendazol 4.43 Time Fenurom, m/z Waters Corporation 215

216 Exatidão de Massas é tudo??? 2012 Waters Corporation 216

217 Análise de Composição Elementar Exatidão de Massas e Padrão Isotópico BMC Bioinformatics 2006, 7, Waters Corporation 217

218 Ferramentas de Software ifit e EleComp Menor Score i-fit corresponde a composição correta 13 C = 15% 13 C = 15% Resultados de composição ordenados por i-fit: menor valor indica maior concordância com padrão teórico 2012 Waters Corporation 218

219 Exatidão de Massas é tudo??? 2012 Waters Corporation 219

220 Resolução x Erro na Medida do Padrão Isotópico 2012 Waters Corporation 220

221 Resolução x Erro na Medida do Padrão Isotópico 2012 Waters Corporation 221

222 Resolução x Erro na Medida do Padrão Isotópico 2012 Waters Corporation 222

223 Faixa Dinâmica no Espectro 2012 Waters Corporation 223