Métodos Físicos de Análise - ESPECTROMETRIA DE MASSAS. Métodos Físicos de Análise. Métodos Físicos de Análise

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1 - ESPECTROMETRIA DE MASSAS Prof. Dr. Leonardo Lucchetti Mestre e Doutor em Ciências Química de Produtos Naturais NPPN/UFRJ Depto. de Química de Produtos Naturais Farmanguinhos Fiocruz Docente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde Fiocruz Docente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica Farmanguinhos Fiocruz Princípio da EM: elementos diferentes podem ser identificados por suas massas O que é a espectrometria de massas? Ferramenta analítica utilizada para medir o peso molecular de uma amostra e obter informação qualitativa estrutural e quantitativa São necessárias apenas concentrações picomolares Acurácia de 0.01% do peso total da amostra e 5ppm para moléculas orgânicas pequenas Para um peso de 40 kda, um erro de 4 Da Útil na determinação de fragmentos de amostras e no sequenciamento de biomoléculas e na identificação de substâncias específicas em misturas complexas 1

2 AULA Métodos 3 Físicos de Análise ESPECTROMETRIA DE MASSAS Espectrometria de massas Visão geral Espetrometria de massas é a geração, separação e caracterização de ions em fase gasosa de acordo com suas massas relativas em função da carga Previamente, o requerimento era que a amostra fosse passível de vaporização (limitação semelhante à CG), porém técnicas de ionização modernas permitem o estudo de moléculas não voláteis (como proteínas e nucleotídeos) A técnica é uma poderosa ferramenta qualitativa e quantitativa; as análises de rotina são realizadas em escala de femtogramas (10-15 g) level, podendo chegar até zeptomoles (10-21 mol) para proteínas Dentre todas as técnicas de espectroscopia orgânica, é usada para os mais diferentes fins: metalurgia, biologia molecular, semicondutores, geologia, arqueologia etc mais que nenhuma outra Encontrar um caminho para carregar um átomo ou molécula (ionização) Colocar o átomo ou molécula em um campo magnético ou submeter a um campo elétrico e medir sua velocidade ou raio de curvatura relativamente à sua razão massa-carga Espectro de massas típico Caracterizado por sinais finos Eixo x indica a razão m/z para os ions (para aqueles com carga simples, corresponde à massa do ion) Altura do sinal indica a abundância relativa de do ion (não confiável para quantificação) Intensidade do sinal indica a capacidade do ion de ser dessorvido ou voar (alguns voam melhor que outros) 2

3 Espectro de massas Usos da espectrometria de massas Descoberta de isótopos Determinação de pesos moleculares Caracterização de novos elementos Análises quantitativas (metabólitos) Identificação de sequências Marcação isotópica Identificação de elementos-traço, poluentes e drogas Limitações As substâncias não podem ser caracterizadas se as amostras não estiverem limpas A técnica não tem grande condição de garantir análise seletiva e sensível de misturas complexas Para moléculas grandes, os espectros são bastante complexos e de difícil interpretação 3

4 Princípios da EM: o espectrômetro amostra _ ionizador analisador de massas detector Como funciona um espectrômetro? 3 partes fundamentais: a fonte de ionização, o analisador e o detector Separação no analisador de acordo com a razão massa/carga (m/z) Detecção dos ions separados e suas abundâncias relativas Sinais enviados ao sistema de dados e formatados num espectro m/z O espectrômetro de massas (esquema geral) Geração de ions as moléculas da amostra são submetidas à fontes que convertem parte delas a ions Separação de ions à medida em que são aceleradas em um campo elétrico, são separadas de acordo com suas razões massacarga (m/z) Detecção de ions à medida em que cada população separada de ions é gerada, o instrumento precisa qualificá-las e quantificá-las As diferenças nos modelos de espectrômetros baseiam-se nas formas diferentes de realizar estas três funções 4

5 Esquema de um espectrômetro ALTO ALTO VÁCUO VÁCUO BOMBAS ENTRADA Inlet DA AMOSTRA FONTE Ion DE Source IONS Mass FILTRO Filter DE MASSAS Detector DETECTOR SISTEMA Data DE System DADOS Sample Inlet de Plate gás Target Probe de HPLC sólidos GC Solids CG probe CLAE MALDI ESI IonSpray FAB LSIMS EI/CI TOF Quadrupolo Ion Trap Setor magnético FTMS Placa de microcanais Multiplicador de eletrons PC Introdução da amostra Inlet de gás Probe de sólidos CG CLAE Cromatógrafo de líquido supercrítico Eletroforese capilar GC-MS (CG-EM) Cromatografia com fase gasosa acoplada à espectrometria de massas separa componentes voláteis na coluna e identifica por massas LC-MS (CL-EM)- Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas separa compostos mais lábeis por CLAE e identifica por massas MS-MS (EM-EM) - Tandem Mass Spectrometry separa fragmentos de compostos por campo magnético e identifica por massas 5

6 Cromatografia com fase gasosa acoplada à espectrometria de massas Configuração mais comum: ionização por impacto de eletrons e filtro de massas quadrupolo Ionização ALTO ALTO VÁCUO VÁCUO BOMBAS ENTRADA Inlet DA AMOSTRA FONTE Ion DE IONS Source Mass FILTRO Filter DE MASSAS Detector DETECTOR SISTEMA Data DE System DADOS Sample Inlet de Plate gás Target Probe de HPLC sólidos GC Solids CG probe CLAE MALDI ESI IonSpray FAB LSIMS EI/CI TOF Quadrupolo Ion Trap Setor magnético FTMS Placa de microcanais Multiplicador de eletrons PC A fonte de ions depende da amostra Amostra sólida Amostra líquida Amostra gasosa transforma em sólido? prepara solução? vaporiza? Propriedades químicas do analito na solução? Propriedades químicas do analito no gás? MALDI ESI CI EI 6

7 Modos de ionização Impacto de eletrons (EI método drástico) Moléculas pequenas ( Daltons): estrutura Ionização química (CI método brando) Moléculas pequenas ( Daltons): ion molecular, grandes fragmentos Fast Atom Bombardment (FAB semi-drástico ) Peptídeos, açúcares (até 6000 Daltons) Eletrospray (ESI semi-drástico ) Peptídeos, proteínas (até Daltons) Matrix Assisted Laser Desorption (MALDI - branda) Peptídeos, proteínas, DNA (até 500kD) Ionização por eletrospray A amostra é dissolvida em tampão polar volátil (sem sais) e bombeado através de um capilar de aço inoxidável (70-150mm) num fluxo de ml/min Alta voltagem (3-4kV) é aplicada no fluxo de gás nebulizado, fazendo com que a amostra também se nebulize (ou se torne um aerossol) O aerossol é direcionado através de regiões de alto vácuo até que as gotículas evaporem até quase o tamanho atômico Pode ser modificada a nanospray com fluxo < 1mL/min Técnica muito sensível: requem menos que um picomol de material Bastante afetada por sais e detergentes Medição via modos positivo ou negativo [(M H) por adição de ácido fórmico ao solvente; (M - H) por adição de amônia ao solvente] Taylor Cone Processo em três etapas 1) Formação da gota 2) Encolhimento da gota 3) Formação de ions gasosos O processo de eletrospray não ioniza as amostras! 7

8 Por que eletrospray? Maioria das amostras são líquidas. CG requer aquecimento da amostra para gerar evaporação Ionização ocorre por impacto de eletrons ou reações químicas Nem todos os analitos são termicamente estáveis Eletrospray foi desenvolvido para garantir uma forma branda de geração de ions gasosos Pode ser facilmente interfaceado com cromatógrafo a líquido Sinais absolutos do eletrospray são mais facilmente reproduzidos garantindo, assim, melhor quantificação Acurácia de massa é considerada melhor Carregamento múltiplo é mais comum que em MALDI MALDI: Matriz Assisted Laser Desorption Ionization Diferente da ESI, MALDI gera espectros que apresentam apenas um ion carregado simples Modo positivo gera ions de (MH) e modo negativo gera ions de (M-H) Geralmente mais robusto que ESI (tolera sais e compostos não voláteis) Maior facilidade de uso e manutenção, capaz de maior escala de trabalho Requer amostra de 10 ml de 1 pmol/ml A amostra é ionizada pelo seu bombardeamento com luz laser A amostra é misturada a uma matriz que absorve no UV (ácido sinapínico para proteínas, ácido 4-hidroxicinâmico para peptídeos, por exemplo) O comprimento de onda iguala ao de máxima absorbância da matriz, fazendo com que ela transfira parte de sua energia ao analito (levando à pulverização dos ions) MALDI O analito é co-depositado com a matriz O laser excita a matriz que, por sua vez, transfere energia para o analito Produz espécies com apenas uma carga Tipicamente usada para biomacromoléculas/polímeros MALDI é comumente combinada com TOF Moléculas da amostra (M) são ionizadas por transferência de protons: XH M MH X 8

9 A matriz Não pode ser volátil (a maioria é sólida em temperatura ambiente) Precisa absorver o comprimento de onda em uso (337nm na maioria dos casos) Preferencialmente solúvel no mesmo solvente da amostra As matrizes são, tipicamente, ácidas: geralmente, um ácido aromático forte que absorve fortemente o laser de N 2 em 335nm e cristaliza Por que MALDI? Menos sensível a sais Menores limites de detecção (na prática) Espectros de interpretação mais fácil (menor número de cargas múltiplas) Rápido e fácil Detecção de massas mais altas Maior rendimento (>1000 amostras por hora) Impacto de eletrons Amostra de interesse é vaporizada no equipamento A energia suficiente para ionização e fragmentação das moléculas do analito é adquirida pela interação com eletrons provenientes de filamento aquecido 70 ev são comumente usados A fonte de eletrons é um fio fino de rênio aquecido eletricamente a uma temperatura na qual emite eletrons livres 9

10 Impacto de eletrons Amostra introduzida no instrumento por aquecimento, até a evaporação A amostra em fase gasosa é bombardeada com eletrons provenientes de filamentos de rênio ou tungstênio (70 ev) A molécula é estilhaçada em fragmentos (70 ev >> 5 ev ligações) Os fragmentos são enviados ao analisador de massas Impacto de eletrons Uma partícula carregada passando por um campo magnético é defletida através de uma trajetória circular, com um raio proporcional à sua relação massa/carga. Num espectrômetro de impacto de eletrons, um feixe de eletrons de alta energia é usado para deslocar um eletron da molécula orgânica para formar um cation radical, conhecido como ion molecular. Se ele for instável, pode ser então fragmentado em outros ions menores. A coleção de ions é então focalizada em um feixe e acelerada para o campo magnético e defletida nas trajetórias circulares de acordo com as massas dos ions. Ao ajustar o campo magnético, os ions podem ser focalizados no detector e registrados Impacto de eletrons e- M e- e- M (g) e - M (g) 2e - M (g) A f rag 1 (g) Bf rag 2 (g) 10

11 Impacto de eletrons Exemplo: fragmentação por IE de CH 3 OH CH 3 OH CH 3 OH CH 3 OH CH 2 O=H H CH 3 OH CH 3 OH CH 2 O=H CHO=H H Impacto de eletrons EM/IE CH 3 OH Molecular ion Quebra da molécula de maneiras previsíveis 11

12 Impacto de eletrons Espectro de massas gerado por impacto de elétrons: formação dos fragmentos Exemplo: Formação do m/z = 57. Exemplo: Formação do m/z = 43 (íon base= 100%). EXEMPLO: cocaína por EI Fragmentação extensa Ion molecular é fraco em m/z

13 Algumas considerações... Espectrômetros comerciais detectam íons com carga positiva (M ou M.) Em rotina, os aparelhos não detectam grupos neutros e nem os carregados negativamente (exigem outras condições). Ao sofrer um impacto de 70eV, a substância perde um elétron e fica instável, o que ocasiona a perda de fragmentos até uma maior estabilidade. A análise dos fragmentos gerados permite inferir sobre a estrutura. Grande parte das substâncias gera íons moleculares estáveis, o que permite o conhecimento do peso molecular. Quanto maior for a capacidade de uma molécula em estabilizar o produto formado a partir do impacto com 70eV, maior será a chance deste chegar ao detector e ser identificado. Nem todas as substâncias podem ser analisadas com a técnica de impacto de elétrons, já que não se ionizam com esta energia ou não podem ser volatilizadas na câmara de ionização ou geram produtos muito instáveis para serem analisados. Assim, existem outras técnicas para transferir energia para a substância para que esta possa se ionizar, como a ionização química. Ionização química Usada para confirmar o peso molecular Reconhecida como uma técnica de ionização branda Difere do impacto pois, alternativamente, as moléculas são ionizadas por interação ou colisão com ions do gás reagente mais do que com eletrons Os gases reagentes mais comumente usados são metano, isobutano e amônia O gás reagente é bombeado diretamente na câmara de ionização e os eletrons do filamento o ionizam Ionização química 1º - ionização eletrônica do CH 4 : CH 4 e - CH 4 2e - Formas fragmentadas: CH 3, CH 2, CH 2º - reações ion-molécula criam ions reagentes estáveis: CH 4 CH 4 CH 3 CH 5 CH 3 CH 4 H 2 C 2 H 5 CH 5 e C 2 H 5 são os ions reagentes dominantes do metano 13

14 Ionização química Forma ions pseudomoleculares (M1) CH 5 M CH 4 MH Ions M1 podem gerar fragmentações posteriores para produzir um espectro complexo Forma adutos C 2 H 5 M [M C 2 H 5 ] (aduto M29) C 3 H 5 M [M C 3 H 5 ] (aduto M41) Ion molecular por transferência de carga CH 4 M M CH 4 Abstração de hidreto (M-1) C 3 H 5 M C 3 H 6 [M-H] EXEMPLO: cocaína por CI Fragmentação limitada Ion molecular é fraco em m/z 303 Ionização em fase gasosa EI e CI são técnicas de ionização em fase gasosa Amostra é aquecida para volatilizar A molécula deve ter peso molecular baixo e polaridade suficientes para que: T vap < T termodecomp 14

15 Ions reagentes do metano (CI) Ions em m/z 17, 29 e 41 são originários do metano; H 3O também se forma pelo vapor d água no sistema de vácuo Cocaína (CI metano) Ions pseudomolecular e fragmentos Cocaína (CI isobutano) Menor fragmentação 15

16 Métodos de ionização (resumo) Quando usar EI e CI? EI Quando é necessário o fingerprint para identificação por comparação em bases de dados Análise de traços Forense Ambiental Desconhecidos totais (ex. produtos naturais) Homologia de fragmentação em uma série (ex. produtos naturais) CI Quando é necessária a identificação confiável do ion molecular LC-MS Acompanhamento de uma rota sintética, identificação de impurezas Amostras biológicas ou outras frágeis ou sensíveis à decomposição (ex. drogas e metabólitos) Minimizar a fragmentação, ganhando maior intensidade no ion molecular 16

17 Filtros de massa/analisadores/separadores de ions ALTO ALTO VÁCUO VÁCUO BOMBAS ENTRADA Inlet DA AMOSTRA FONTE Ion DE IONS Source Mass FILTRO Filter DE MASSAS Detector DETECTOR SISTEMA Data DE System DADOS Sample Inlet de Plate gás Target Probe de HPLC sólidos GC Solids CG probe CLAE MALDI ESI IonSpray FAB LSIMS EI/CI TOF Quadrupolo Ion Trap Setor magnético FTMS Placa de microcanais Multiplicador de eletrons PC Modo positivo ou negativo? Se a amostra contém grupos funcionais que sejam bons aceptores H (como amida e grupos amino presentes em peptídeos e proteínas) então a detecção positiva é usada Se a amostra apresenta grupos funcionais que percam protons facilmente (como ácidos carboxílicos e hidroxilas, como as encontradas em ácidos nucleicos ou açúcares), então a detecção negativa é usada 17

18 Analisadores de massas Setor magnético (MSA) Alta resolução, massa exata (é o analisador original) Quadrupolo (Q) Baixa resolução (1 u.m.a.), rápido, barato Tempo-de-voo (Time-of-Flight - TOF) Sem limite de m/z, alto rendimento Ion Trap Boa resolução, analisador all-in-one Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR) Mais alta resolução, massa exata, caro Tempo-de-voo (TOF, TOF-MALDI) Mede o tempo requerido para os ions voarem pela extensão da câmara Comumente combinado com MALDI Tandem MS - MS/MS - MS n Separação e identificação de componentes em misturas complexas Induz fragmentação e analisa os fragmentos Usa dois ou mais analisadores/filtros separados por uma célula de colisão Diferentes configurações de MS-MS Quadrupolo - quadrupolo (baixa energia) Setor magnético - quadrupolo (alta energia) Quadrupolo - tempo-de-voo (baixa energia) Tempo-de-voo tempo-de-voo (baixa energia) LC/LC-MS/MS-Tandem LC, Tandem MS 18

19 Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) A ideia é fragmentar ions a partir de ions-pai para obter informação estrutural sobre uma molécula Permite ainda separação de massa e identificação em misturas complexas Usa dois ou mais analisadores/filtros separados por uma célula de colisão preenchida com argônio ou xenônio A célula de colusão é onde os ions selecionados são direcionados para posterior fragmentação Tandem Mass Spectrometry (MS/MS) O primeiro (MS1) é usado para SELECIONAR, nos ions primários, aquele(s) com um valor de m/z para passar na região de fragmentação. O ion selecionado é o ion-pai e pode ser o ion molecular resultante da fragmentação primária. A DISSOCIAÇÃO ocorre na região de fragmentação. Os ions filhos são analisados num segundo espectrômetro (MS2). Na verdade, o MS1 pode ser visto como fonte de ions para MS2. MS1 MS2 Por que Tandem Mass Spectrometry (MS/MS)? Identificação de desconhecidos Potencialmente dois compostos de interesse têm a mesma massa (e o mesmo tempo de retenção) Melhorias quantitativas (redução do ruído) 19

20 Setor magnético Setor magnético Setor magnético 20

21 Quadrupolo Quadrupolo Consiste de quatro hastes metálicas paralelas com diferentes cargas Duas hastes opostas apresentam potencial positivo e as outras duas apresentam potencial negativo As voltagens aplicadas afetam a trajetória dos ions que migram ao longo do trajeto de voo Para determinadas voltagens de correntes alternada ou contínua, somente ions com razões massa-carga específicas passam pelo quadrupolo e todos os demais ions são ejetados de sua trajetória original Quadrupolo Quatro magnetos hiperbólicos em seção cruzada, são arranjados; em um par é aplicada corrente alternada; no outro, aplica-se corrente contínua Somente um ion em particular consegue ressonar adequadamente e atingir o detector A vantagem é o tamanho compacto do instrumento cada haste tem o tamanho aproximada de uma caneta esferográfica 21

22 Quadrupolo Quadrupolos 22

23 Quadrupolo O tamanho compacto e a velocidade destes instrumentos propiciam que eles sejam eficientes e poderosos como detectores para CG: uma vez que os compostos já se encontram vaporizados, somente o gás carreador precisa ser eliminar para que o processo ocorra Pequeno: as moléculas são facilmente defletidas de suas trajetórias e são ejetadas pelo vácuo; os ions mais pesados, como maiores momenta, tendem a permanecer no centro do jato e são enviados ao detector interface GC-MS: uma bomba é usada para evacuar a interface Quadrupolo Tempo-de-voo (TOF) 23

24 Tempo-de-voo (TOF) Tempo-de-voo (TOF) Tempo-de-voo (TOF) 24

25 TOF Ion Trap São dispositivos que fazem uso de campos de quadrupolos tridimensionais para capturar e analisar as massas dos ions com bom poder de resolução Ion Trap 25

26 Ion traps ION TRAPS x QUADRUPOLOS Separação de massa no tempo Separação de massa no espaço Alta sensibilidade varredura total Estágios múltiplos de detecção de massas (MSn) Alta resolução Baixa sensibilidade varredura total Não há estágios múltiplos Perda da varredura de espécies neutras FT-Ion Cyclotron 26

27 Ion cyclotron resonance - FT Usa um magneto poderoso (5-10 Tesla) para criar um ciclotron em miniatura Abordagem por FT permite a determinação simultâne de muitas massas de ions - EFICIÊNCIA Apresenta resolução mais alta que qualquer outro analisador de massas disponível 27

28 Espectrômetro de massas Espectrômetro de massas Detecção ALTO VÁCUO ALTO VÁCUO BOMBAS ENTRADA Inlet DA AMOSTRA FONTE Ion DE IONS Source Mass FILTRO Filter DE MASSAS Detector DETECTOR SISTEMA Data DE System DADOS Sample Inlet de Plate gás Target Probe de HPLC sólidos GC Solids CG probe CLAE MALDI ESI IonSpray FAB LSIMS EI/CI TOF Quadrupolo Ion Trap Setor magnético FTMS Placa de microcanais Multiplicador de eletrons PC 28

29 Detectores Os primeiros usavam filmes fotográficos Hoje, produzem sinais eletrônicos quando atingidos por ions Mecanismos de tempo integram estes sinais com voltagens em varredura que permitem ao instrumento registrar a m/z que atinge o detector Necessitam de calibragem constante e regular Monitoram a corrente de ions, amplificam e transmitem o sinal para o sistema de dados Mais comuns: Fotomultiplicador Multiplicador eletrônico Placa de microcanais O espectro de massas Apresentação: abundância relativa x razão m/z (massa) o ion mais abundante formado durante a ionização gera o sinal mais alto no espectro = pico-base pico-base, m/z 43 O espectro de massas Todos os demais picos são relativos ao pico-base e expressos como porcentagem Se a molécula perde somente um eletron no processo de ionização, o ion molecular é observado e fornece seu peso molecular designado como M no espectro M, m/e

30 O espectro de massas Na maioria dos casos, quando a molécula perde um eletron de valência, as ligações são quebradas ou o ion formado rapidamente se fragmenta gerando ions de mais baixa energia As massas dos ions carregados são registrados como fragmentos iônicos fragmentos neutros não são registrados! fragmentos O espectro de massas Quando um pico M é observado, ele fornece a massa molecuar considerando que cada átomo se encontra em sua forma isotópica mais abundante Lembrar que o carbono é uma mistura de 98,9% de 12 C, 1,1% de 13 C e menos que 0,1% de 14 C na tabela periódica, a massa de 12,011 é a média Por sua natureza, o espectrômetro de massas vê um sinal de massa 12 como carbono e um pico M1 em 13, que apresentará 1,1% da altura do primeiro Determinação da massa molecular Algumas moléculas são altamente frágeis e os picos M não são observados um método usado para confirmar a presença de um pico M é reduzir a voltagem de ionização ions de energia mais baixa não fragmentam facilmente Três fatos são aplicáveis ao pico do ion molecular: O pico deve corresponder ao ion de massa mais alta no espectro, excluindo os picos de isótopos O ion deve ter número ímpar de eletrons geralmente, um cation radical O ion deve ser capaz de gerar outros fragmentos no espectro pela perda lógica de fragmentos neutros Determinando padrões isotópicos no espectro de massas Espectrômetros de massas são capazes de separar e detectar ions individuais, mesmo que suas diferenças sejam de apenas uma unidade de massa Como resultado, moléculas que contenham isótopos diferentes podem ser distinguidos Isto é mais claro quando átomos tais como bromo ou cloro estão presentes ( 79 Br: 81 Br, intensidade 1:1; 35 Cl: 37 Cl, intensidade 3:1) quando picos em "M" e "M2" puderem ser obtidos A razão das intensidades nos padrões dos isótopos são devidas às abundâncias naturais dos isótopos Picos de "M1 são vistos devido à presença de 13 C na amostra 30

31 Espectro de Massas gerado por impacto de elétrons: presença de M2 em substâncias contendo cloro (M2 1/3 do M) e bromo (M2 = M) EM/IE CH 3 Br Isótopos podem ajudar na identificação de compostos EM x RMN Picos em EM são mais finos que em RMN EM é muito mais sensível (10 4 x) que RMN (está entre as ferramentas analíticas mais sensíveis) Com EM é possível analisar moléculas muito maiores (>50 kd) Amostras para EM são mais difíceis de serem preparadas EM não é propriamente quantitativa Espectrômetros de massas custam um pouco menos que os de RMN 31

32 A regra do nitrogênio Moléculas contendo átomos limitados a C, H, O, N, S, X e P de massa molecular par contêm número par ou não contêm nitrogênio (também se aplica a radicais) serve para confirmar a presença de um ion molecular Não se aplica a cations radicais No caso da ionização química, onde se observa [MH], subtrair de 1 e então aplicar a regra Exemplo: se uma substância não contém nitrogênio e gera um ion em m/z 201, então este pico não pode ser o do ion molecular Se a molécula contém número par de nitrogênios ou não contém este elemento, o ion molecular apresentará relação massa/carga par; por outro lado, se a molécula contém número ímpar de nitrogênios, o ion molecular terá massa ímpar Se a molécula contém cloro ou bromo, cada qual com dois isótopos comuns, a determinação do M pode ser simplificada ou dificultada!... A regra dos 13 e a predição da fórmula 1. Tome o peso do ion e divida por Esta resposta é o n, para (CH) N e qualquer sobra é adicionada como H Ex /13 = 7 com sobra de 1; C 7 H 8 pesa 92. Este é a fórmula candidata Pode-se avaliar outras alternativas que possuam heteroátomos. Para cada membro da lista abaixo, substitua o número indicado de CHs na resposta abaixo Hetero substituição CH substituição Hetero substituição O CH 4 P C 2 H 7 N CH 2 S C 2 H 8 ON C 2 H 6 OS C 4 F CH 7 I C 10 H 7 CH substituição Si C 2 H 4 Cl,Br (usar isótopos) Rearranjo de McLafferty Cations radicais localizados no oxigênio da forma ceto podem ser β-clivados O mecanismo se limita à fragmentação por impacto de eletrons É necessário um H em um carbono γ de hibridação sp 3 Cetonas, ésteres, ácidos carboxílicos geram produtos por este rearranjo H R1 R2 H O O R1 R2 O H 32

33 Clivagem α de C=O : O. : O neutro : O : CH 3 C=O m/z=43 Clivagem α em heteroátomos (O, N) R : O. neutro R : O:. Clivagem heterolítica Rearranjos e fragmentações que geram bons carbocations C H 2 Cation benzílico (estabilizado como tropílio) m/z=91 H C C H C H 2 C H 2 C H 33

34 Aminas -R N R Aminas cíclicas perderão H adjacentes formando ion imínio A clivagem retro Diels-Alder Cicloexenos com estado de transição de 6 membros favorável; pode incluir heteroátomos (N,O) QUESTÕES DE CONCURSOS 34

35 O espectrômetro de massas é um equipamento que fornece dados para a identificação de compostos. Ele pode ser acoplado a um cromatógrafo de modo a permitir a identificação de vários compostos presentes em uma mesma amostra. O espectro de massas é produzido quando: a) a molécula do analito é fragmentada por ação de forças magnéticas; b) a molécula do analito é excitada por um feixe de luz e a luz emitida pela molécula é captada pelo detector; c) a molécula do analito absorve energia proveniente de radiação eletromagnética sofrendo vários tipos de excitação; d) dois protons adjacentes quimicamente diferentes, alinham-se em relação a um campo magnético externo; e) a molécula do analito é bombardeada em fase gasosa por um feixe de elétrons. (PERITO LEGISTA TOXICOLOGIA PF) Ao selecionar o monitoramento seletivo de íons na análise por espectrometria de massas, devemos utilizar algum critério para garantir que estamos identificando corretamente o composto. O critério considerado de maior segurança é quando a identificação pode ser concluída se o analito possuir: a) o íon de maior intensidade do composto padrão de comparação; b) pelo menos 3 íons característicos do composto padrão de comparação; c) o mesmo tempo de retenção no cromatograma, ainda que os íons sejam diferentes do composto padrão de comparação; d) pelo menos 2 íons característicos do composto padrão de comparação; e) pelo menos alguns íons característicos, ainda que ainda que o tempo de retenção no cromatograma seja diferente do composto padrão de comparação. (PERITO LEGISTA TOXICOLOGIA PF) 45 Julgue as afirmações abaixo, sobre a espectrometria de massas: I Um espectro de massa é o registro do que acontece com as moléculas quantos estas são bombardeadas em fase gasosa por um feixe de elétrons, em um instrumento chamado espectrômetro de massas. II As moléculas são destruídas em pedaços. Usualmente é possível deduzir do estudo dos fragmentos a estrutura da molécula original. III Os espectros de massa podem ser também usados para determinar a extensão e localização da incorporação de isótopos. IV Durante a interação entre a molécula e o elétron de alta energia há transferência de energia para a molécula. Uma das maneiras pelas quais as moléculas excitada pode dissipar a energia em excesso é pela ejeção de um elétron, ficando positivamente carregada. V Geralmente a pressão da amostra de espectrômetro e massa não ultrapassa 10-5 mm Hg. Nesta baixa pressão podem ocorrer os fragmentos e rearranjos intramoleculares, mas a probabilidade de ração intermoleculares entre ions ou moléculas neutras é baixa. São verdadeiras: a) I,II,IV e V b) I,II e III c) II,III e V d) Todas as afirmações (PERITO PF 1993 ENG.QUÍMICA/FARMÁCIA/QUÍMICA/C.BIOLÓGICAS/BIOQUÍMICA) 35