Espectrometria de massas e proteômica BCM Fundamentos de Análises de Proteínas (2011/2)

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1 Espectrometria de massas e proteômica BCM Fundamentos de Análises de Proteínas (2011/2) Dr. diogord@terra.com.br Laboratório de Proteínas Tóxicas Centro de Biotecnologia e Departamento de Biofísica - UFRGS

2 Introdução 1. Espectrometria de massas a) Histórico; b) Fundamentos básicos; c) Componentes e tipos de equipamentos; d) Tipos de ionização; e) Tipos de fragmentação; f) Detecção; 2. Proteômica a) Preparo de amostras (2D, 1D, GeLC, HPLC, etc...); b) Abordagens (Botton Up & Top Down, fosfo, PTM); c) Fragmentação de peptídeos; d) Proteômica quantitativa;

3 1.a - Histórico Prof. Charley Staats

4 1.b - Fundamentos básicos Medida da relação massa/carga de um íon Diferentes de outras técnicas, MS não envolve uma região específica do espectro eletromagnético; massa/carga (m/z): massa do íon / carga do íon 1 unidade de massa atômica = 1 Da = 1/12 massa 12 C. 1 kda = 1000 amu

5 1.b - Fundamentos básicos 8000 Resolution =18100 Counts Resolution = Resolution = Mass (m/z) Prof. Charley Staats

6 1.c Componentes e tipos de equipamentos IONIZAÇÃO ANÁLISE DETECÇÃO Electron Ionization (EI) Chemical Ionization (CI/APCI) Sector Mass Analyzers (Magnetic and Electrostatic) Quadrupole Analyzers MCP Microchannel Plate Detectors Photo-ionization (APPI) Ion Traps Electrospray (ESI) Ion Cyclotron Resonance Matrix-assisted Laser Desorption (MALDI) Field Desorption (FD) Time-of-Flight Plasma Desorption (PD) Fast atom bombardment (FAB) High-temperature Plasma (ICP Adaptado de Villanova University

7 1.c Componentes e tipos de equipamentos A MONTAGEM DO EQUIPAMENTO É FEITA ATRAVÉS DA COMBINAÇÃO DOS COMPONENTES Aebersold R, Mann M Mass spectrometry-based proteomics. Nature 422,

8 1.c Componentes e tipos de equipamentos IONIZAÇÃO ANÁLISE DETECÇÃO MALDI TOF ESI Q DESI Qq SELDI QQQ LTQ

9 1.d- Tipos de ionização MALDI (dessorção) MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization) The technique which we now know as matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) was developed simultaneously in two laboratories in The first report of high mass ions (above m/z 10,000) was a paper presented by Koichi Tanaka of the Shimadzu Corporation (Kyoto, Japan) at the Second Japan-China Joint Symposium on Mass Spectrometry, held September 15-18, 1987 in Takarazuka, Japan. Using a pulsed N 2 laser (337 nm) and a time-of-flight mass spectrometer equipped with a coaxial reflectron, they recorded molecular ions at m/z 34,529 from carboxypeptidase-a dissolved in a slurry of glycerol and an ultra-fine metal powder. In addition, they reported a mass spectrum of lysozyme (MW 14,307) containing multimeric ions up to the pentamer recorded at m/z 71,736. At the same time, Michael Karas and Franz Hillenkamp from the University of Muenster (Germany) had developed a matrix-assisted technique using a frequency-quadrupled (266 nm) Q- switched Nd:YAG laser to desorb intact molecular ions from proteins dissolved in matrix solution containing nicotinic acid. Their first high mass results were reported at the International Mass Spectrometry Conference (IMSC) in Bordeaux, France in August 1988, and included molecular ions for bovine serum albumin observed in their mass spectrum at m/z 66,750. Results from both of these groups were first published in 1988, followed by a number of other reports by Hillenkamp and Karas for proteins with molecular weights in excess of 100 kda. Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y; Yoshida, T., Rapid Commun. Mass Spectrom. 2 (1988) Karas, M.; Hillenkamp, F., Anal. Chem. 60 (1988) Skoog. Principles of Intrumental Analysis th Ed.

10 1.d- Tipos de ionização MALDI (dessorção) Laser TRASFERÊNCIA DE ENERGIA ENTRE A MATRIZ E O ANALÍTO AMBOS VOOAM!! A M placa

11 1.d- Tipos de ionização MALDI (dessorção)

12 1.d- Tipos de ionização MALDI (dessorção) Íon [M+H] + Menos sensível a contaminantes Sensibilidade: fentomol Análise high-troughput (rápido e relativamente fácil)

13 1.d- Tipos de ionização ESI (fase gasosa) Método adequado para análise de moléculas termolábeis, como proteínas. O processo de ionização das moléculas ocorre pela nebulização de gotículas (nanolitros) de uma solução em um campo elétrico intenso, formando gotículas altamente carregadas. Quando o solvente evapora, formam-se íons moleculares de simples ou múltiplas cargas. Podem ser formados íons (-) ou (+), de acordo com o campo eléctrico aplicado. No modo positivo, observam-se adutos alcalinos (protonados) dos analitos e no modo negativo, os íons são desprotonados (M + nh) n+

14 1.d- Tipos de ionização ESI (fase gasosa) Modo positivo (protonados) Modo negativo (deprotonados) 1- formação de microgotículas; 2- evaporação do solvente (gás)- rompimento do limite de Rayleigh; 3- ionização (formas multicarregadas) (M+nH) n+ ; 4- entrada no espectrômetro

15 1.d- Tipos de ionização ESI (fase gasosa) -Automatização; -Acoplamento a sistemas cromatográficos; -Geração de íons multicarregados;

16 1.d- Tipos de ionização demais tipos de ionização Electron Ionization (EI) bombardeamento; fragmentação excessiva; Chemical Ionization (CI/APCI) tranferência de prótons através do uso de gás (CH 4 ) Photo-ionization (APPI) ioniza o que ESI não consegue. Desorption-electrospray ionization (DESI) combinaçãod MALDI e ESI (incidência de laser e spray, em uma matriz sobre uma placa NÃO inerte) Fast atom bombardment (FAB)- moléculas lábeis. High-temperature Plasma (ICP) fluxos na ordem de 50 ml/min!!!!

17 1.d- Tipos de ionização comparativo

18 1.e- Tipos de FRAGMENTAÇÃO Por que fragmentar? Como fragmentar? Como analisar? Como DETECAR? CID: COLLISION INDUCED DISSOCIATION COLISÃO FÍSICA ENTRE O ÍON PRECURSOR E UM GÁS (Ar, He, N 2 ); EDT: ELECTRON TRANSFER DISSOCIATION REAGENTE ANIÔNICO TRANSFERE ENERGIA PARA O PEPTÍDEO POSITIVO; ECD: ELECTRON CAPTURE DISSOCIATION CONVERSÃO DO PEPTÍDEO IONIZADO PARA UMA FORMA RADICALAR INFRARED MULTHIPHOTON DISSOCIATION ABSORÇÃO DE FÓTONS

19 1.f- Detecção MCP: U$ ,00 Do tamanho de uma moeda de UM REAL!!!

20 2.a- Proteômica Preparo de amostras Tecido de origem Tratamento necessário à resposta biológica; Remoção de contaminantes; Digestão das proteínas a peptídeos;

21 2.a- Proteômica Preparo de amostras -digestão Reduzir as proteínas a peptídeos; Expor ao máximo os sítios de clivagem (redução com DTT seguida de alquilação) Digestão por enzimas (geralmente tripsina, alta especificidae (Arg/Lis) Anal Bioanal Chem (2007) 389: O PREPARO DAS AMOSTRAS É PONTO CRÍTICO DE QUALQUER EXPERIMENTO PROTEÔMICO

22 2.a- Proteômica Preparo de amostras Remoção de contaminantes Detergentes, sais, açúcares, etc... O espectrômetro NÃO sabe que estamos trabalhando com peptídeos Enriquecimento de peptídeos de interesse, modificados ou não Enriquecimento de peptídeos fosforilados, atrvés do uso de cromatografias de afinidade por metal imobilizao (Fe, Ti, Ga); Pré-fracionamento das amostras para análise Eletroforese uni ou bi-dimensional, cromatrografias diversas. Associação de cromatrografias de troca catiônica forte, com fase reversa: MuDPIT

23 2.a- Proteômica Preparo de amostras fosfopeptídeos MOMENTO BIOQUÍMICO Proteomics 2009, 9,

24 2.a- Proteômica Preparo de amostras - Overview

25 2.a- Proteômica Preparo de amostras Gel-1D Gel-2D Cromatografia multidimensional

26 2.a- Proteômica Preparo de amostras 1D 2D

27 2.a- Proteômica Preparo de amostras - MudPIT 1000 A 280 /ml mm NaCl % ACN 50 % ACN 50 % ACN

28 2.b- Proteômica Abordagens Botton upe Top down

29 2.c- Proteômica Resolução e analisadores Peptide fingerprint ou impressão digital de peptídeos: proteínas são identificadas com base no tamanho dos peptídeos resultantes da hidrólise com tripsina, comparando-se o espectro de massa real com o teórico, obtido a partir dos bancos de dados de proteínas. Massa/carga Mass Tolerance (Da) # Hits in Database Quanto maior a exatidão da medida de massas, maior a segurança na identificação da proteína (hits) que originou os peptídeos trípticos.

30 2.c- Proteômica Analisadores 1 MS-Setor magnético: os íons moleculares são focalizados, formando um feixe, são acelerados através de um campo magnético, sendo defletidos (desviados) de acordo com as massas dos íons

31 2.c- Proteômica Analisadores 2- Quadrupolo: quatro eletrodos longos ou não, com cargas opostas e paralelas

32 2.c- Proteômica Analisadores (quadrupolo)

33 2.c- Proteômica Analisadores (quadrupolo)

34 2.c- Proteômica Analisadores 3- Ion trap: literalmente, armadilha de íons.

35 2.c- Proteômica Analisadores (ion trap) - Transmissão em feixes; - Armazenamento temporário dos íons;

36 2.c- Proteômica Analisadores 3- TOF: time of flight TOF TEMPO DE VÔO DEPENDE DA ENERGIA CINÉTICA 1 2 m t =. D 2eV TOF/TOF

37 2.c- Proteômica Analisadores (TOF)

38 2.c- Proteômica Analisadores (TOF) Rápido Fácil de usar Resolucão moderada Moléculas grandes ( 70 kda )

39 2.c- Proteômica MS/MS e fragmentacão de peptídeos PEPTÍDEO PEPTÍDEO PROTONADO

40 2.c- Proteômica MS/MS e fragmentacão de peptídeos

41 2.c- Proteômica MS/MS e fragmentacão de peptídeos

42 2.c- Proteômica MS/MS e fragmentacão de peptídeos Sequenciamento de novo de proteínas Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a fragmentação gera uma família de fragmentos peptídicos com massas que vão diferir uma da outra em valores que correspondem a um íon b, permitindo a identificação de cada aminoácido.

43 2.c- Proteômica MS/MS e fragmentacão de peptídeos A sequência obtida pela análise dos íons de uma série pode ser confirmada pela determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso do exemplo, os íons y.

44 Espectro MS/MS do peptídeo tríptico GLSDGEWQQVLNVWGK. AA Codes Mono. AA Codes Mono. Gly G Asp D Ala A Gln Q Ser S Lys K Pro P Glu E Val V Met M Thr T His H Cys C Phe F Leu L Arg R Ile I CMC Asn N Tyr Y Trp W

45 2.d- Proteômica e a análise de dados

46 2.d- Proteômica e a análise de dados Comparação de massas reais obtidas no equipamento, com massas teoricas; Rastreamento contra bancos de dados; MASCOT: socore SEQUEST: Xcorr Escores diferentes para um hit ; Número de peptídeos únicos que identificam uma proteína

47 QUANTIFICATION BASED ON NUMBER OF ACQUIRED MS 2 SPECTRA Nano-LC MS 2 intensity Spectra 1 Peptide 1 MS Time (min) Spectra 2 Peptide 2 intensity Spectra 3 Peptide 3 m/z m/z

48 60 min acquisition time 36,000 acquired spectra/hour 5-10 scans/second Nano-LC intensity Time (min) MS MS 2

49 Spectrum 1 Peptide 1 Spectrum 2 Peptide 2 Spectrum 3 Peptide 3 MS 2 AAELTNLFES DNGMHALIIYDDLSKQAVAY TGSIVDVPAGKAMLG MELSPRAAEL TNLFESRIRN FYANFQVDEI GRVVSVGDGI AQVYGLNEIQ AGEMVLFANG HIGH CONFIDENCE MATHING CRITERIA ATPase alpha subunit : gi VKGMALNLEN ENVGIVVFGG DTAIKEGDLV KRTGSIVDVP AGKAMLGRVV DAMGVPIDGR GALSDHEQRR VEVKAPGILE RKSVHEPMQT GLKAVDSLVP IGRGQRELLI GDRQTGKTTI AIDTILNQKQ INSRATSESE TMYCVYVAIG QKRSTVGQLI QTLEEANALE YSILVAATAS - PROTEIN PROBABILITY: >95% - Minimun of 2 unique non-overlapping peptides - Xcorr: +1; : : 2.5 DPAPLQFLAP YSGCAMGEYF RDNGMHALII YDDLSKQAVA YRQMSLLLRR PPGREAFPGD VFYLHSRLLE RAAKRSDQTG AGSLTALPVI ETQAGDVSAY IPTNVISITD GQICLETELF YRGIRPAINV GLSVSRVGSA AQLKAMKQVC GSSKLELAQY REVAAFAQFG SDLDAATQAL LNRGARLTEV PKQPQYAPLP IEKQILVIYA AVNGFCDRMP LDRISQYEKA IPNSVKPELL QALKGGLTNE RKMEPDAFLK ERALALI ATPase alpha subunit : gi SEQUEST algorithms Scaffold TM algorithms

50 2.e- Proteômica quantitativa Label-free: livre de marcação Labelled: itraq marcação isotópica ( 18 O)