Mass Analyzers. Mass Spectrometry. Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas (Sequencial)

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1 Universidade Federal de Santa Maria (UFSM) Departamento de Química Campus da UFSM Santa Maria - RS Prof. Dr. Renato Zanella rzanella@base.ufsm.br Mass Spectrometry Cromatografia Líquida Acoplada à Espectrometria de Massas (Sequencial) Técnicas de Ionização e de Massas 2011 Liquid Chromatography Very important! Many columns Many solvent systems Ionization ESI APCI APPI Mass Analyzer Triple Quadrapoles Ion-Traps Hybrids Detector/ Data Collection 2 Mass Analyzers Em LCMS/MS (MRM) a intensidade do pico do analito é baixa se comparada a uma análise LCMS realizada no modo SIM (Single Ion Monitoring). No entanto, o LCMS/MS fornece maior sensibilidade que o LCMS devido à melhora significativa dos níveis de ruído com consequente aumento da relação sinal/ruído. Double Focusing Magnetic Sector Quadrupole Mass Filter Quadrupole Ion Trap Linear Time-of-Flight (TOF) Reflectron TOF Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR-MS) 3 4

2 Spray Chamber Main Components of the LC-MS Q0 Triple Quadrupole Configuration Q1 Q2 Q3 Ion Optics Mass Filter Detector RF only Scanning RF/DC RF only Collision Cell Scanning RF/DC Q1 and Q3 are standard mass filter quadrupoles. The can scan masses sequentially (e.g. 50 to 500 amu) The can be used to select a single mass. Q2 is an RF only quadrupole that is in a gas filled chamber. Q2 is the collision cell where mass fragmentation occurs. Q2 does not filter ions. It accepts all ion sent to it by Q1 and passes all ions formed by collision to Q3 to be sorted. QqQ 5 6 Cromatograma de padrões de 226 pesticidas obtidos em 2 minutos. Ao realizar medidas dos íons (MS/MS automático ou íons específicos) no modo MRM, espectros de massa do íon precursor podem ser obtidos durante uma transição MRM. A estrutura do composto pode ser simultaneamente confirmada pelo espectro do produto resultante do íon devido à alta seletividade durante o MRM e sem a interferência de coeluição com outras substâncias. 7 Medida simultânea de íons produzidos no modo MRM. 500 transições MRM em um segundo 8

3 Q0 Q1 Q2 Q3 RF only Scanning RF/DC RF only Collision Cell Scanning RF/DC 100,000 API-Electrospray 10,000 Molecular Weight 1000 APCI GC/MS Particle Beam Thermospray FAB MRM = monitoramento de múltiplas reações (Multiple Reaction Monitoring) MRM é também chamado de SRM (Selected Reaction Monitoring) 9 Nonpolar Very polar 10 Mass Spectrometry Mass Spectrometry Terms and Definitions Molecular ion / precursor ion Ion formed by ionization of the analyte species Fragment ions / product ions Ions formed by the gas-phase dissociation of the molecular ion Relative Abundance Relative Abundance is a measure of the relative amount of ion signal recorded by the detector 11 12

4 Gas-Phase Methods Electron Impact (EI) Chemical Ionization (CI) Ionization Techniques GC Spray Methods Electrospray (ESI) Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Atmospheric Pressure Photo-Ionization (APPI) New dual sources (ESI/APCI) or (APCI/APPI) Electron Impact GC Desorption Methods Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) Fast Atom Bombardment (FAB) Well-Established Fragmentation Libraries No Supression Insoluble Samples Interface to GC Non-Polar Samples Electron Impact (low picomole) Parent Identification Need Volatile Sample Need Thermal Stability No Interface to LC Low Mass Compounds (<1000 amu) Solids Probe Requires Skilled Operator Chemical Ionization GC 15 16

5 Parent Ion Interface to GC Insoluble Samples Chemical Ionization (low picomole) No Fragment Library Need Volatile Sample Need Thermal Stability Quantitation Difficult Low Mass Compounds (<1000 amu) Solids Probe Requires Skilled Operator 17 Electrospray Ionization (ESI) (Eletronebulização) (up to 6 kv) 18 Electrospray Ionization (ESI) Electrospray: Types of Ions Formed ESI can operate in either + or - mode. Typical ions produced by electrospray ionisation: Positive mode: [M+H]+ protonated molecule [M+Na] +, [M+K] + adducts [M+CH3CN+H] + protonated, + solvent adducts Positive mode: Best suited to basic drugs that form a stable HCl salt. [M+H] + is the primary ion formed [M+nH] n+ and [M+Na + ] + can also be formed. Negative mode: Best suited to acidic drugs that form stable Na salts. [M-H] -, [M-nH] n- and [M+I - ] - [M-H] - deprotonated molecule Negative mode: [M+HCOO -] -, adducts 19 20

6 + + API-Electrospray Ionization Atmospheric Pressure Ionization Nebulizer (gas shown in red) Electrospray Ions V Heated nitrogen drying gas Increasing fragmentation with increasing cone voltage. The fragmentation obtained by in source fragmentation is useful for confirming a peak identity, getting structure information, improving selectivity, building libraries Solvent spray Dielectric capillary entrance Evaporation Rayleigh Limit Coulomb Explosion Evaporation Analyte Ion Electrospray Ionization (ESI) ESI = Ionização por eletronebulização à pressão atmosférica 1º) Bombeamento da amostra através de uma agulha nebulizadora; 2º) Aplicação de uma voltagem entre a agulha e o cone que a rodeia; 3º) Formação de uma nuvem de gotículas carregadas; 4º) Evaporação do solvente devido à presença de um dispositivo aquecido; 5º) Aumento da densidade de cargas na superfície das gotículas; 6º) Repulsão entre as cargas até os íons evaporarem das gotículas. 23 Parent Ion High Mass Compounds (>100,000 amu) Thermally Labile Compounds (<0º C) Easy to Operate Interface to HPLC Zeptomole sensitivity with nanospray ESI (low femtomole to zeptomole) No Fragmentation Need Polar Sample Need Solubility in Polar Solvent (MeOH, ACN, H 2 O, Acetone are best) Sensitive to Salts Supression 24

7 Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) Atmospheric Pressure Ionization Atmospheric Pressure Chemical Ionization (APCI) APCI = Ionização Química à Pressão Atmosférica 1º) Bombeamento da amostra através de um capilar; 2º) Vaporização do solvente e da amostra, por um dispositivo aquecido; 3º) Ocorre descarga elétrica em coroa; 4º) Ionização do solvente da fase móvel; 5º) Os íons formados reagem com as moléculas do analito. Solvent molecules (S) being protonated by the corona (SH+), then reacting with the analyte molecule (M) to give the protonated form MH Parent Ion Insensitive to Salts Interface to HPLC Can use Normal Phase Solvents Handles High Flow Rates APCI (high femtomole) Need Volatile Sample Need Thermal Stability Seleção da fonte: Experiência do laboratório e o tipo de instrumento; ESI é mais frequentemente utilizada; Facilidade do uso; Robustez; Seletividade para mais compostos ESI : técnica preferida e menos propensa a degradação térmica trabalha numa faixa mais ampla de compostos APCI: Máxima sensibilidade no modo íon positivo para compostos neutros; Para compostos de íon negativo que requer captura de elétron para ionização (nitratos) APCI : N-metilcarbamatos, compostos neutros 27 28

8 Principais Diferenças entre APCI e ESI Mecanismo de Ionização: Enquanto ESI tem voltagem aplicada à ponta do spray, APCI apresenta um nebulizador aquecido e pneumaticamente assistido. A voltagem (~3 kv) é aplicada a uma agulha de metal na saída do spray. A descarga Corona ioniza as moléculas do solvente que por sua vez ionizam os analitos por transferência de prótons formando [M+H]+ ou [MH]- Vazão da FM: APCI tolera vazões na ordem de 0,2 a 2,0 ml/min, enquanto que ESI opera no máximo até 1,0 ml/min. ESI é melhor indicado para fluxos tão baixos quanto 5 μl/min, compatível com acoplamentos capilares (μlc ou CZE). Fragmentação: Devido ao uso de aquecimento, APCI pode produzir alguma fragmentação, enquanto que ESI pode até formar alguns íons pseudo-moleculares. APCI não produz cargas múltiplas, portanto não é adequado para compostos de alta MM. Sensibilidade: Sem ser uma regra, APCI tende a render melhor sensibilidade para solutos menos polares. 29 Ionisation Techniques ESI characteristics Soft ionization method, provides molecular weight information. Suitable for analyzing large bio- or synthetic polymers. Suitable for analyzing polar and even ionic compounds. Less fragmentation. APCI characteristics Provides molecular weight information. Suitable for analyzing less polar compounds compared to ESI. Increased fragmentation compared to ESI. MALDI characteristics Soft ionization method, provides molecular weight information. Suitable for analyzing very large bio- or synthetic polymers. Suitable for analyzing polar and even ionic compounds. Less fragmentation. 30 ESI e APCI Atmospheric pressure photoionization (APPI) The photoionization mechanism is simplified under vacuum conditions: photon absorption by the analyte molecule, leading to electron ejection, forming a molecular radical cation M. + Priority pollutant PAHs in surface and drinking water by LC/APPI/MS-MS Two specific transitions per compound were selected for simultaneous monitoring in SRM mode. LC-MS/MS SRM chromatograms of a standard solution (100 μg L -1 ; 1000 μg L -1 for Naphth, Fluor) 31 32

9 Photoionization APPI Source [A-m] + + m Drugs S Fragmentation Chemical weapons Aromatics MeOH, AcCN, chloro-solvents IP A + H 2 O, CO 2, O 2, N 2 Ionization potential Energy [ev] IP Benefits of Photoionization Ionizes wide range of compounds (e.g., non-polars, electronegative cpds, etc.) Predominantly parent ion signal Minimum fragmentation Minimum solvent signal Solvent (S) Analyte (A) Minimum ion suppression Signal linear with concentration Direct APPI vs. Dopant-assisted APPI M + hv M + + e - M + + S MH + + S[-H] D + hv D + + e - D + + M MH + + D[-H] D + + M M + + D Direct APPI Analyte molecule M is ionized to a molecular radical ion M +. (If analyte ionization potential is below photon energy) In the presence of protic solvents, M + may abstract a hydrogen atom to form MH +. Dopant APPI A photoionizable dopant is delivered in large concentration to yield many D + ions. D + ionizes analyte M by proton or electron transfer. This is PI-initiated APCI Which is Best ionization source? It depends on the exact application. Increasing polarity and molecular weight and thermal instability favors ESI. Most drugs of abuse are highly polar and are easily analyzed using ESI. High molecular weight proteins also require ESI Lower polarity and molecular weight favors APCI or APPI. Lower background, but compounds must be more thermally stable

10 Fast Atom Bombardment (FAB) FAB (nanomole) Parent Ion No Fragment Library High Mass Compounds Solubility in Matrix (MNBA, (10,000 amu) Glycerol) Quantitation Difficult Thermally Labile Compounds (R.T.) Needs Highly Skilled Operator Relatively Low Sensitivity Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) MALDI (low femtomole) Parent Ion No Fragment Library High Mass Compounds Wide variety of matrices (>100,000 amu) Thermally Labile Quantitation Difficult Compounds (R.T.) Easy to Operate

11 Three Acquisition Modes: Data Acquisition Modes SIM vs SRM Scanning Complete spectra are repeatedly measured between two extreme masses Double-Focusing Magnetic Sector Very High Resolution (60,000) High Accuracy (<5 ppm) 10,000 Mass Range Selected-Ion Monitoring If the analysis aims at detecting target compounds of known spectral characteristics with maximum sensitivity Selected-Reaction Monitoring Detection of selected reactions, based on the decomposition reactions of ions that are characteristic of the compounds to be analysed Very Expensive Requires Skilled Operator Difficult to Interface to ESI Low resolution MS/MS without multiple analyzers Analisador Quadrupolar (Q) Analisador de varredura Conjunto de 4 pólos de sinais opostos, que alternam sinais de radiofreqüência entre pares, permitindo que apenas um íon atinja o detector de cada vez How Does a Quadrupole Mass Filter Work? Filtering High Mass M + * Negative Rods Filtering Selected Mass Positive Rods M + Filtering Low Mass M + * Positive Rods 43 Filters out all m/z values except the one it is set to pass Obtains a mass spectrum by sweeping across the entire mass range 44

12 MS/MS with Triple Quadrupoles The analyser of a triple quad instrument consists in two quadrupoles, separated by a collision cell. Such a configuration is often referred as a "tandem in space" instrument. Precursor ions and product ions are created and analysed in different physical spaces. MS/MS with Triple Quadrupoles A triple quad instrument can be used in various ways, which are represented on the next figure. The firsts two experiments are in fact using the triple quad in a single quadrupole mode 45 - The first quad (Q1) is set to pass one ion of interest - The second quad (q2) is set to pass all ions and is flooded with a collision gas to fragment the parent ion present (collision induced dissociation or CID) - The third quad (Q3) obtains a daughter ion spectrum by sweeping across the desired mass range 46 CID = Dissociação induzida por colisão Os íons são acelerados para aumentar a energia cinética passar em uma câmara com o gás de colisão. Usa-se, geralmente: Ar para o Triplo Quadrupolo He para a Ion Trap e o uso da fonte CID tem desvantagens importantes, como a dificuldade prática de funcionamento na voltagem ótima de fragmentação para todos compostos em um método multirresíduo. As desvantagens podem ser resolvidas trabalhando com MS/MS Sequencial pelo uso do Triplo Quadrupolo ou sistemas Íon Trap porque a voltagem usada pode ser mais baixa ou semelhante para todos os compostos e o número de fragmentos produzidos pode ser controlado por um bom ajuste do MS/MS para especificar a fragmentação e produzir espectros simples

13 Quadrupole Mass Analyzer/Filter Inexpensive Easily Interfaced to Many Ionization Methods Low Resolution (<4000) Low Accuracy (>100 ppm) MS/MS requires multiple analyzers Low Mass Range (<4000) Slow Scanning Ion-Trap Analyzer Ion-Trap Analyzer MS/MS MS Acúmulo de íons no interior de um campo quadrupolar 3D; Liberação controlada de íons de diferentes massas; Permite realizar MS n 51 52

14 Quadrupole Ion Trap Espectrômetros de Massas em Sequência (MS/MS) Inexpensive Easily Interfaced to Many Ionization Methods MS/MS in one analyzer Low Resolution (<4000) Low Accuracy (>100ppm) Space Charging Causes Mass Shifts Low Mass Range (<4000) Slow Scanning A informação é aumentada com a combinação de dois MS; A técnica permite a medida de fragmentação de um pico selecionado em um espectro de massa que produz o espectro de massas do íon precursor; Podem ser de dois modos: Consecutivos no espaço usando dois espectrometros separados; Sucessivos no tempo usando a mesma massa no sistema mais de uma vez (ion trap) Linear Time-of-Flight (TOF) Reflectron Time-of-Flight (TOF) íons são produzidos em pulsos e acelerados em alta velocidade por um campo elétrico num tubo de deslocamento. a distância da origem até o detector é fixa, o tempo que o íon leva para atravessar o analisador é inversamente proporcional a sua velocidade Extremely High Mass Range (>1 MDa) Fast Scanning Low Resolution (4000) Low Accuracy (>200 ppm) MS/MS not possible 55 High Resolution (>20,000 in some models) High Accuracy (<5ppm) 10,000 Mass Range Fast Scanning Low Resolution for MS/MS 56

15 Sistema Q-TOF/MS Combinação de um MS Quadrupolo com um analisador TOF O ESPECTRO DE MASSAS QUADRUPOLE MS TOF MS Espectro de massas = diagrama da intensidade relativa dos picos em função das razões massa-carga. Z-spray íon souce Hexapole íon bridge Quadrupole MS-MS Hexapole collision cell Reflectron Algumas características do Q-TOF/MS Espectros de massas contínuos full-scan tornam o MS/MS Q TOF mais sensível ( vezes) que os Quadrupolos em sequência; TOF e o MS/MS Q TOF tem a mesma sensibilidade no modo scan e no modo de seleção do íon; A maior capacidade do MS/MS Q TOF comparado com instrumentos Triplo Quadrupolo e MS/MS Íon Trap está na sua habilidade para determinar massas precisas nos fragmentos de íons gerados na cela de colisão. 57 Pico base = pico com a intensidade mais alta, arbitrariamente assinalada em 100. Em LC-MS o pico base geralmente é a molécula protonada e corresponde ao íon positivo mais estável; Íon molecular = é o pico de maior razão massa-carga e representa o peso molecular do composto. 58 The API Mass Spectrum Electrospray (ESI) and APCI are both API (atmospheric pressure ionisation) techniques and produce a soft ionisation. Thus, the MS spectra obtained with API ionisation will consist mainly of the "molecular" ions, unless fragmentation techniques are applied. The possible fragmentation techniques are in source CID (collision induced dissociation), CID in the collision cell of a tandem type instrument, fragmentation in an ion trap. This is very different from the spectra obtained with EI (electron impact ionisation). Operating conditions Eluent: the mobile phase must be suitable for ionisation. If it is not the case, a small amount of modifier can be added, in order to generate the solvent gas phase ions. Buffers: buffers must be volatile. Tampões voláteis (ex. Formiato de amônio) concentração do tampão, ácido ou base usado para ajustar o ph deveriam ser o mais baixa possível (0,1%); Substitute phosphates, sulfates, and borates with ammonium acetate or formate, trifluoroacetic acid (TFA), heptafluorobutric acid (HFBA), tetrabutylammonium hydroxide (TBAH) sulfamethazine spectrum Negative ESI mass spectrum for glucose, with chloride adducts

16 Choosing Between Ionization Techniques General rules can be given to chose between ESI, APCI, or EI. ESI is preferred for compounds which are ionic or very polar or thermo labile, or with masses higher than 1000 APCI is preferred for compounds which are not very polar. If we take the example of pesticides, we can rule out that: polar pesticides will be in ESI, less polar in APCI, volatiles in APCI, non polar better done with GC/EI Mass Definition The mass spectrometer measures the exact mass. Looking at the below mass spectra, the most abundant peak is at (top) and (bottom). These spectra are obtained with positive ionisation (top) and negative ionisation (bottom). The peaks correspond to the protonated or deprotonated molecule. 61 If we look for the molecular mass of the chloridazon pesticide, we can find various values in the spectra : this is the average mass. It is based on the average atomic masses : this is the nominal mass, calculated on the nominal mass of the most abundant isotopes : this is the exact (or monoisotopic) mass, based on the exact mass of the most abundant natural isotopes The value is slightly different from the expected and because these spectra were obtained with a quadrupole instrument, which does not provide sufficient mass resolution and mass accuracy for obtaining the exact mass. The next smaller peaks correspond to the C13 and Cl37 isotopes. 62 Benzoylurea pesticides ESI - Organophosphorus ESI

17 Carbamate analysis by LC/MS Column: Ultra Carbamate, 100 x 4.6 mm, 3 µm Conc.: 100 µg/l each Mobile Phase: A: 90:10 water:methanol + 10 mm ammonium formate B: 10:90 acetonitrile:methanol + 10 mm ammonium formate Gradient: 90:10 A:B to 10:90 A:B from 0-15 min. Flow-rate: 0.25mL/min Mode: ESI+ Mass Spectra Base Peak: most abundant ion in spectrum abundance [M + H] + Psuedomolecular ion or Quasi-molecular ion A + 1 from naturally { A + 2 occurring isotopes 65 mass/charge 66 Comparação entre instrumentos MS/MS Instrumento Sensibilidade em full scan Seletividade Exatidão Faixa dinamica Características Triplo quadrupolo baixa alta baixa alta Perda Neutra MS/MS Ion trap alta alta baixa média MS n LC/TOF/MS alta média alta média Massa exta e sensibilidade LC/QTOF/MS média alta alta média Massa exata dos fragmentos Seletividade superior em LC-MS comparada com LC-UV Instrumento Características Vantagens Desvantagens Q-TOF MS/MS Triplo Quadrupolo MS/MS Massa exata dos fragmentos de íons Muito sensível em MS/MS para quase todos íons precursores selecionados Full scan do íon precursor Muito caro Não é possível perda neutra Perda Neutra Sensível para quantificação no modo MRM Não dá a massa exata Quadrupolo Ion Trap MS n Sensível no scan de fragmentos facilmente deduziveis Não é possível Perda Neutra e MRM Será a técnica LC-TOF-MS a melhor solução? 67 68

18 Figures of Merit for Mass Analyzers Development of Methods for the determination of cyanotoxins in surface and drinking water by using SPE and LC/MS-MS Type m/z range Resolving Power Cost Double Focusing ,000 $$$$ Single Focusing $$$ Quadrupole $$ Ion trap $$ Time of flight 1-100,000 30,000 $$$ Fourier Transform 18-10,000 >100,000 $$$$ LC/MS/MS SRM chromatograms of a standard solution of MC-RR, MC-YR, MC-LR, MC-LA and NOD (20 mg/l) T. Triantis et al., Toxicon, 2010, 55, LCMS/MS analyses of strigolactones in root exudates Yoneyama K et al. Plant Cell Physiol 2010;51:

19 Sistemas de LC-MS Water soluble vitamins LC-MS/MS 73 74