PADRONIZAÇÃO DA METODOLOGIA DE AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTICOLINESTERÁSICA EM FÁRMACOS E EXTRATOS VEGETAIS

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1 Ciências da Vida Farmácia PADRONIZAÇÃO DA METODOLOGIA DE AVALIAÇÃO DA AÇÃO ANTICOLINESTERÁSICA EM FÁRMACOS E EXTRATOS VEGETAIS Robson Cristiano Lillo Vizin¹; Luis Carlos Marques 2 Palavras chaves Atividade anticolinesterásica, Reagente de Ellman, Guaraná, Croton echioides INTRODUÇÃO Nas últimas décadas, com os avanços tecnológicos e de serviços de saúde, tem ocorrido o envelhecimento populacional, com a idade média das pessoas aumentando progressivamente. Nesse cenário aumentam, também, as doenças ligadas ao envelhecimento, como a doença de Parkinson e particularmente as demências, como a de Alzheimer (Yaffe, 2010). Em vista disso, tem aumentado igualmente as pesquisas para novos medicamentos que contribuam à prevenção ou tratamento das demências, com destaque às substâncias anticolinesterásicas que melhoram o quadro sintomático dos pacientes permitindo recuperação parcial das atividades cotidianas prejudicadas pela doença (Larner, 2010). A acetilcolinesterase é uma enzima responsável pela degradação da acetilcolina, neurotransmissor que no sistema nervoso central é responsável pela cognição e a sua falta pode leva a doenças como a de Alzheimer. Desse modo, bioensaios utilizando acetilcolina ou moléculas afins como substrato à enzima acetilcolinesterase tem sido amplamente promovidos, como modelos rápidos e acessíveis para triagem de fármacos ou extratos potenciais para desenvolvimento de novos medicamentos a esta área (Trevisan, 2003). OBJETIVOS a) Padronizar e instalar na Uniban uma metodologia de avaliação da atividade anticolinesterásica de fármacos e extratos vegetais; b) Estudar o potencial anticolinesterásico de fármacos e extratos vegetais, em particular de extratos de guaraná (controle positivo, já citado em literatura) e de Croton echioides, objeto de investigação do projeto docente do orientador; c) Elaborar POP s de análise permitindo sua realização por outros pesquisadores da instituição. MATERIAIS E MÉTODOS Tampões Foram preparados os seguintes tampões: (1) 50 mm Tris/HCl ph 8; (2) 50 mm Tris/HCl ph 8, contendo 0,1% de Albumina sérica bovina (BSA) ; (3) 50 mm Tris/HCl ph 8, contendo 0,1 M de NaCl e 0,02 M de MgCl2.6H2O;

2 (4) Fosfato de Potássio ph 7.4, 0.1M contendo 0.9% NaCl e 0,05% de Triton X- 100 Enzimas A enzima AChE liofilizada (Sigma-Aldrich) foi dissolvida na solução tampão (1) para fazer uma solução estoque 1000 U/mL, deixando-se na solução por 20 min, depois sob agitação por mais um período de min, para obtenção de uma solução homogênea. Para o ensaio em CCD a solução estoque foi diluída no reagente (1) até obter uma concentração de 3 U/ml e para o ensaio em microplaca a solução estoque foi diluída em tampão (2) até uma concentração de 0,226 U/ml. Substrato Iodeto de acetilcolina foi o substrato utilizado nos ensaios em CCD e microplaca, nas concentrações de 1 mm e 15 mm respectivamente. Reagente colorimétrico Ácido 5,5'-ditiobis-[2-nitrobenzóico] (DTNB ou reagente de Ellman) foi utilizado nos ensaios em CCD e por leituras espectrofotométricas nas concentrações 1 mm em tampão (1) e 3mM em tampão (3) respectivamente. Placas de cromatografia em camada delgada Foram utilizadas cromatofolhas de alumínio e sílica gel 60 F 254 (Merck). Espectrofotômetro Foi empregado neste teste o espectrofotômetro marca Micronal, modelo B 582, disponível no campus Maria Cândida onde este experimento foi finalizado. Realizaram-se as leituras utilizando-se o comprimento de onda 405 nm. Sistemas Eluentes Para a análise em cromatografia delgada (CCD) foram utilizadas os seguintes eluentes: clorofórmio:etanol:ác.fórmico (45:4:1) para o extrato de Guaraná (Paulinia cupana) e clorofórmio:metanol (8:2) para o extrato de Croton echioides (Novello et al., 2006). Extrato de Guaraná Pesamos, em balança analítica, 01 grama da droga vegetal pulverizada com o auxílio de uma espátula e um vidro de relógio, transferimos para erlenmeyer com tampa. Adicionamos 03 ml de hidróxido de amônio a 25% (V/V) e 40 ml de diclorometano. Agitamos por 15 minutos em agitador magnético. Filtramos através de algodão e concentramos 5 ml do filtrado à secura em banho-maria. Ressuspendemos o resíduo em 1 ml de metanol (Farmacopéia Brasileira, 1988). Extrato de Croton Pesamos em uma balança analítica 100mg do extrato liofilizado da droga vegetal diretamente em um béquer de 50 ml e solubilizamos em 10 ml de etanol 70% (Miyazaki et al., 2010).

3 Ensaio em cromatografia de camada delgada Aplicamos manualmente fazendo-se uso de tubos capilares de vidro, a amostra (Extrato Cróton) e o padrão (Extrato de Guaraná) em placas separadas, várias vezes, até obter uma mancha concentrada em ambas as aplicações. Corremos as placas em béquer de vidro contendo o eluente correspondente, em quantidade suficiente para atingir a margem estabelecida, coberto com um vidro de relógio. Os cromatogramas foram retirados assim que a frente da fase móvel atingir o limite superior. Deixamos que as placas secassem à temperatura ambiente. Sobre os cromatogramas, com auxílio de um borrifador plástico, borrifamos com a solução de Acetiltiocolina, aguardamos secagem por aproximadamente 5 minutos e posteriormente com o Reagente de Ellman a fim de cobrir toda a sílica, porém com cautela para haver escorrimento. Aguardamos a secagem em temperatura ambiente e, posteriormente, borrifamos com a solução enzimática de Acetilcolinesterase. Ensaio espectrofotométrico O ensaio consistiu na leitura individual de cada amostra (padrão, amostra em análise e branco), sendo que em uma cubeta adicionamos, em seqüência, os reagentes: 0,25mL da solução de iodeto de acetiltiocolina; 1,25 ml da solução do reagente Ellman; 0,5mL da solução tampão D; 0,25 ml da solução de amostra (extrato guaraná / croton). Realizamos 8 leituras, uma a cada 13 segundos, a 405nm para medição da hidrólise espontânea. Em seguida adicionamos 0,25mL da enzima e realizamos outras 8 leituras a 405nm, uma a cada 13 segundos. Dos resultados pós-enzima são subtraídos os valores da hidrólise não-enzimática. Como branco (controle) utilizou-se 10% metanol em Tampão B, a qual foram adicionados, assim como nas amostras e padrão, respeitando os intervalos de aplicação e leitura, 0,25mL da solução de iodeto de acetiltiocolina; 1,25 ml da solução do reagente Ellman; 0,5mL da solução tampão D; 0,25 ml da solução Enzimática Acetilcolinesterase a 0,22 U/ml. A velocidade máxima da reação enzimática foi obtida por regressão linear da medição da DO/min., usando 8 pontos. O cálculo de inibição enzimática foi obtido pela expressão (SEIDL, 2010): % inibição = (taxa da reação amostra/taxa da reação controle x 100). Testes adicionais A realização das técnicas por várias vezes indicou a necessidade de alguns cuidados na preparação e conservação dos reagentes, cuidados esses que foram destacados e montados como instruções adicionais complementando assim as orientações para a internalização das técnicas na Uniban. RESULTADOS E DISCUSSÃO Ellman e colaboradores descreveram, em 1961, um método fotométrico para a determinação da atividade anticolinesterásica. O método se baseia na medição da taxa de produção da tiocolina à medida que a acetilcolina é hidrolisada pela acetilcolinesterase. Décadas depois, Rhee e colaboradores (2001) desenvolveram um sistema rápido e eficaz para a detecção de substâncias inibidoras de acetilcolinesterase, utilizando cromatografia em camada delgada (CCD). Neste teste é visualizado um campo amarelo com manchas brancas na placa de CCD,

4 sendo esses halos brancos o indicativo da inibição da enzima que impede a formação de complexo colorido da tiocolina com o reagente de Ellman. Teste em CCD Este teste mostrou-se adequado e de fácil execução, resultado positivo para o padrão guaraná bem como para o extrato teste (Croton echioides). Foi possível verificar que há a necessidade de aliquotar-se a enzima logo após sua preparação inicial, dividindo-a em vários frascos para congelamento, pois sua atividade decai com o descongelamento. Teste espectrofotométrico As leituras espectrofotométricas individuais por concentração por oito vezes consecutivas geraram dados da cinética enzimática da acetilcolinesterase influenciada pela presença de várias concentrações do extrato teste versus o padrão. Assim, considerando-se o valor da linha do controle como 100% de atividade enzimática (tubo sem inibidor da ação da enzima) e comparando-se com os valores dos extratos num mesmo ponto de leitura (p.ex.: tempo 7), obtém-se que o extrato de guaraná inibe 35,5% da ação da anticolinesterase. Já os extratos de C. echioides 1 e 5 mg/ml inibem, respectivamente, 3,2% e 76,8% da ação da enzima, demonstrando em termos quantitativos uma faixa de ação potencial para essa atividade farmacológica, de acordo com a dose utilizada. A partir desses dados estimou-se a IC50 do extrato para 2,87 mg. CONCLUSÕES As metodologias de avaliação da atividade anticolinesterásica de fármacos e extratos vegetais em placa cromatográfica e em espectrofotômetro segundo a literatura é exeqüível e tem totais condições de ser adaptada e implantada em protocolos de investigação rotineira nas pesquisas farmacológicas e biológicas realizadas na Uniban tomando-se os POPs como base para tal. Os custos dos reagentes são medianos e acessíveis a projetos com financiamentos mínimos e os laboratórios da Uniban apresentam as condições básicas para sua realização. Através dos ensaios em CCD e espectrofotométrico, baseados no método de Ellman et al. (1991) modificado por Rhee et al. (2001), foi possível internalizar as referidas metodologias à Uniban, que servirá para pesquisas futuras com fármacos e extratos de uso potencial em patologias neurodegenerativas. Em paralelo, pode-se confirmar o potencial anticolinesterásico da espécie Croton echioides caules, utilizada como produto teste na validação da metodologia. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. ELLMANN GL, COURTNEY KD, ANDRES JRV, FEATHERSTONE RM. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem Pharmacol., 7:88-90, FARMACOPÉIA BRASILEIRA. 4ª.ed. São Paulo: Atheneu, LARNER AJ. Cholinesterase inhibitors: beyond Alzheimer s disease. Expert Rev Neurother Nov;10(11):

5 4. MIYAZAKI CR, GONÇALVES ID, MENDES FR, NOVELLO CR, MELLO JCP, CARNEIRO-TORRES DS, MARQUES LC. Farmacologia do extrato hidroalcoólico de Croton echioides Baill. em modelos experimentais de sistema nervoso central. In: XXI Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil. Anais. João Pessoa: Universidade Federal da Paraíba, NOVELLO CR, SANTOS FEITOSA KP, GAZARINI L, GONÇALVES BCM, MARQUES LC, MELLO JCP. Otimização de extração do lenho de Croton moritibensis Baill com avaliação da capacidade antioxidante. In: XIX Simpósio de Plantas Medicinais do Brasil. Anais. Salvador: Universidade Federal da Bahia, RHEE IR, VAN DE MEENT M. Screening for acetylcholinesterase inhibitors from Amaryllidaceae using silica gel thin-layer chromatography combination with bioactivity staining. J Chromatography A 915: , TREVISAN MTS. Seleção de plantas com atividade anticolinesterase para tratamento da doença de Alzheimer. Química Nova, São Paulo, vol.26, n. 3, YAFFE K. Treatment of Alzheimer disease and prognosis of dementia: time to translate research to results. JAMA. 3;304(17):1952-3, 2010.