PRODUÇÃO SUSTENTÁVEL DE BIOSSURFACTANTES: INTEGRANDO PROCESSOS PARA A COPRODUÇÃO DE BIOMASSA, BIOSSURFACTANTES E ALFA-AMILASE

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1 PRODUÇÃO SUSTENTÁVEL DE BIOSSURFACTANTES: INTEGRANDO PROCESSOS PARA A COPRODUÇÃO DE BIOMASSA, BIOSSURFACTANTES E ALFA-AMILASE Marília Rossi Maretti Faculdade de Química CEATEC ma.maretti@gmail.com Augusto Etchegaray Júnior Química ambiental e dos materiais CEATEC augusto.etchegaray@puc-campinas.edu.br Resumo: O objetivo deste trabalho é apresentar uma estratégia que possa diminuir os custos da produção de biossurfactantes a partir da coprodução de biomassa, biossurfactantes e amilase, ou seja, agregando valor aos extratos e resíduos da produção de biossurfactantes. Palavras-chave: biossurfactantes, alfa-amilase, biomassa. Área do conhecimento: Ciências Exatas e da Terra Química dos Produtos Naturais. 1. INTRODUÇÂO Bacillus subtilis é conhecido pela produção de compostos com atividade antifúngica e surfactantes, entre estes iturinas e surfactinas, ambos elaborados pela síntese não ribossômica de peptídeos, com aplicações para o controle de patógenos de plantas e também na área médica [1]. Outra aplicação destes biossurfactantes inclui a remoção de óleo e de metais, especialmente por surfactina que possuem dois sítios com carga negativa, envolvendo portanto interação eletrostática [2-4]. Adicionalmente, B. subtilis assim como outras bactérias possui componentes na parede celular que podem ser utilizados para interações com diversos compostos [3]. Desta forma, a produção de biomassa microbiana e a produção de biossurfactantes de B. subtilis encontram aplicações importantes, sendo necessário o estudo da produção de ambas matérias primas de forma sustentável para que se possa diminuir os custos da produção do insumo principal (biossurfactantes). Assim sendo, considerando-se a importância destes surfactantes naturais para processos químicos e para descontaminação ambiental e a importância da biomassa microbiana como adsorvente natural de poluentes ambientais além da presença de enzimas como alfa-amilase no extrato livre de células - o objetivo deste trabalho é apresentar uma estratégia que possa contribuir para diminuir os custos da produção de biossurfactantes a partir da produção de mais de um insumo. 2. METODOLOGIA 2.1.Material Foi utilizada a bactéria Bacillus subtilis cepa 0G. Para o meio de Landy modificado foram utilizados os substratos e micronutrientes: glicerol e/ou caldo de banana, milho ou salsicha, MgSO 4, KCl, KH 2 PO 4, extrato de levedura, FeSO 4, MnSO 4, CuSO 4, glutamato e/ou arginina. Para avaliar a produção de alfa-amilase foram utilizados os seguintes reagentes: ácido dinitrosalicílico (DNS) (6%), solução de maltose (0,55 mg/ml), tampão Tris-HCl 25 milimolar ph 7,0, amido solúvel 1% e solução de NaOH 2 mol/l. Para os testes de remoção do corante azul de metileno foram utilizados uma solução estoque de azul de metileno (1 g/l), e suspensão de B. subtilis produzidos em diversos meios de cultivo Meio de cultura para bioensaio O meio de Landy modificado foi utilizado para o cultivo de do B. subtilis [1]. Os componentes foram diluídos em água deionizada e/ou caldos preparados a partir do cozimento dos substratos banana com casca, milho e salsicha, como indicado na Tabela 1. O ph do meio foi ajustado para 7,0 antes de esterilizar. Cada 100 ml de meio de cultura foi transferido para erlenmeyers de 500 ml e autoclavados a 120 C, ~ 1,5 atm durante 20 minutos.

2 Tabela 1. Componentes e suas respectivas concentrações usados no meio de Landy modificado. Componentes Glicerol ou Caldo banana ou Caldo de milho ou caldo de salsicha Concentração (g/l) 20,0 0,5 L* MgSO 4 0,5 KCl 0,5 KH 2 PO 4 1,0 Extrato de levedura 1,0 NaNO 3 0,0020 FeSO 4 0,15 MnSO 4 0,05 CuSO 4 0,016 Glutamato; Arginina; 5,0 Caldo de salsicha 0,5 L *Na utilização de caldo de alimentos foram adicionados 500 ml do caldo em substituição ao glicerol Metodologia empregada no crescimento O meio de cultura é inoculado com 1 ml de um pré-inóculo de B. subtilis cultivado a 37 C durante 24 h. Este inóculo foi adicionado a 100 ml do meio colocado na incubadora a 37 C sob agitação constante 150 rpm. O tempo de cultivo variou de 24 a 72 horas Biossurfactantes A obtenção de surfactina e outros lipopeptídeos pode ser feita a partir de 24 horas de crescimento da bactéria. Para a obtenção, é centrifugado o meio e coletado 1 ml do sobrenadante em um Eppendorf previamente pesado. Neste, é adicionado 10% de ácido clorídrico, no caso, 100 µl de HCl 1 mol/l. O ácido faz com que a surfactina perca a solubilidade, formando precipitado após 5 minutos na geladeira. Após este tempo, o meio é centrifugado novamente e é retirado o sobrenadante, deixando as células no fundo do Eppendorf. Este Eppendorf é deixado em um frasco com sílica gel, dentro da estufa a 40 C, durante 24 horas. No dia seguinte, o Eppendorf é pesado novamente, obtendo-se assim o peso de surfactinas e outros biossurfactantes que coprecipitam nestas condições Atividade enzimática para caracterização da alfa-amilase Para verificar a atividade enzimática, são adicionados 250µL de extrato de Bacillus previamente centrifugado com 500 µl de tampão Tris-HCl e 250 µl de amido solúvel 1%. Esta reação é colocada em banho-maria por 30 minutos a 35 C. Dado este tempo, são adicionados 1000 µl de DNS e 1000 µl de água e a reação é recolocada em banho-maria por mais 10 minutos a 100 C. Em seguida, adicionam-se 9 ml de água. A partir desta reação enzimática, é determinado o teor de maltose gerada pela ação da enzima alfa-amilase no extrato de B. subtilis. A absorbância do produto é determinada em 540 nm, utilizando espectrofotômetro ou uma leitora de microplacas. Uma unidade de alfa-amilase é definida como a quantidade de enzima que libera 1 micromol de maltose a partir do amido em 3 minutos de reação a 35 C, em ph 7,0 [5] Purificação parcial da enzima alfa amilase utilizando acetona Para separar as enzimas segregadas no meio de cultura dos biossurfactantes, também produzidos e excretados pela bactéria durante o cultivo, ao final do crescimento, o meio de cultura foi centrifugado (6000 g) por 10 min. O sobrenadante foi tratado com acetona na concentração final de 50% sob-refrigeração (4 C 30 min). A suspensão foi centrifugada (6000 g) por 10 min, produzindo um sobrenadante que contém biossurfactantes e um precipitado que proteínas [6]. O precipitado foi ressuspendido em tampão tampão fosfato ph 7,2 e utilizado no teste de atividade enzimática. Adicionalmente, foi avaliada a capacidade de remoção pelo tratamento com sulfato de amônio, adicionando-se diretamente o sal ao extrato e incubando-se a 4 C durante 30 min, seguido de centrifugação (6000 g) por 10 min Utilização dos extratos e biomassa para remoção de azul de metileno Para os testes foi preparada uma curva analítica utilizando uma solução estoque de azul de metileno 0,1%. A absorbância das diluições foi determinada em 495 nm. Este ensaio foi feito em duas partes. A primeira foi feita utilizando

3 Absorbância (495 nm) Anais do XIX Encontro de Iniciação Científica da PUC-Campinas ISSN biomassa, proveniente do crescimento de 50 ml do meio de Landy modificado em 24 horas, centrifugada e ressuspendida em 50 ml de água. A segunda foi feita utilizando 50 ml o extrato (biomassa + sobrenadante) do crescimento do meio de Landy em 24 horas. Em ambos, o tratamento foi feito utilizando uma proporção de um volume da solução de azul de metileno para um volume da suspensão de biossurfactantes. 3. RESULTADOS 2,5 2 1,5 1 0, ,05 0,1 0,15 0,2 Maltose (mg ml -1 ) 3.1. Crescimento do B. subtilis em meio de Landy modificado B. subtilis foi cultivado em meio de Landy modificado, conforme indicado na Tabela 1. Para avaliar o efeito da adição de mais de um substrato junto foi produzido um meio misto contendo 10% de cada substrato. Tabela 2. Peso de células no meio de Landy contendo os respectivos caldos. Meio Tubo 1 Tubo 2 Média Misto 0,003 g/ml 0,003 g/ml 0,003 g/ml B. Nanica 0,004 g/ml 0,004 g/ml 0,004 g/ml B. Prata 0,002 g/ml 0,004 g/ml 0,003 g/ml Salsicha 0,005 g/ml 0,005 g/ml 0,005 g/ml Milho Landy 0,004 g/ml 0,003 g/ml 0,0035 g/ml 0,004 g/ml 0,002 g/ml 0,003 g/ml Os resultados indicam que meio contendo caldo de salsicha como substrato produz mais biomassa Produção de α-amilase Para avaliar a produção atividade de alfa-amilase nos extratos foi preparada uma curva analítica de maltose, que permite avaliar a conversão do substrato (amido solúvel) em maltose [5]. Figura 1. Curva analítica de maltose A produção de α-amilase foi feita a partir de vários meios, como mostra a Tabela 3. Tabela 3. Atividade de alfa-amilase produzida em meio de Landy modificado utilizando caldo de banana, salsicha, milho e com a mistura de todos em 24 horas. Meio Alfa-amilase Atividade total em 100 ml de meio de cultura bruto Misto 220 u u Banana 200 u u Salsicha 140 u u Milho 200 u u Landy 170 u u 3.3. Purificação parcial da alfa-amilase Após a reação enzimática do meio contendo caldo de banana, este foi centrifugado e coletado o sobrenadante. Este foi tratado com sulfato de amônio e o sobrenadante avaliado para a atividade de alfa amilase, indicando que o após o tratamento com 50% ainda resta atividade enzimática no sobrenadante (Tabela 4). Realizando-se um teste semelhante com acetona, verifica-se que é possível recuperar a enzima que apresentou 150 unidades, após precipitação e ressuspensão em tampão fosfato.

4 Tabela 4. Atividade de alfa-amilase remanescente após o tratamento com sulfato de amônio. Tabela 6. Remoção do azul de metileno utilizando o extrato livre de células. Teste Sulfato de amônio Alfa-amilase Meio Remoção (%) 1 10% 58,8 u 2 20% 57,9 u 3 30% 56,7 u 4 40% 53,8 u 5 50% 52,6 u Tudo 19,16 Banana Nanica 22,28 Banana Prata 85,83 Milho 14,16 Landy 6, Remoção do corante azul de metileno Considerando-se que o aproveitamento da biomassa, poderia tornar o cultivo de B. subtilis mais sustentável, foi avaliada a sua utilização como adsorvente natural para a remoção de azul de metileno. Os resultados demonstram rendimentos diferentes dependendo do substrato presente no meio de cultura (Tabela 5). Tabela 5. Remoção do corante utilizando a biomassa dos respectivos meios de cultura. Meio Remoção (%) Misto 66,72 Banana Nanica 86,29 Banana Prata 96,78 Salsicha 10,79 Milho 33,58 Landy 22,25 A Tabela 6 apresenta o mesmo estudo utilizando o desta vez o extrato contendo biossurfactantes, demonstrando uma contribuição importante da biomassa em suspensão quando comparada com o extrato livre de células. 4. CONCLUSÕES Diversos meios de cultivo podem ser produzidos modificando a fonte de carbono. A utilização de fontes contendo amido propicia a coprodução de biossurfactantes e alfa-amilase como caldos de banana e de milho utilizados em substituição à glicose no meio de Landy (Tabelas 1 e 3). É interessante observar que um meio de cultivo que possui uma mistura dos caldos de banana, milho e salsicha apresentou um ótimo rendimento de alfa-amilase ( unidades), considerando-se o volume inicial de meio de 100 ml. Os meios de cultivo e a biomassa, após centrifugação e ressuspensão em água, também demonstraram uma aplicação para remediação de água contaminada com azul de metileno. Portanto, concluímos que a coprodução de biomassa, biossurfactantes e alfa-amilase pode representar uma redução dos custos da produção de biossurfactantes, porque pode ser agregado valor ao extrato e à biomassa que seria descartada ao final do cultivo. 5. AGRADECIMENTOS À pró-reitoria de pesquisa (PUC-Campinas) pela oportunidade, ao CNPq pela bolsa de iniciação científica e à Fapesp (auxílio 2013/ ). 6. REFERÊNCIAS [1] Kinsella, K., et al. (2009) Rapid quantification of Bacillus subtilis antibiotics in the rhizosphere. Soil Biol. Biochem.,vol. 41, n. 3, p

5 [2] Schaller, K. D., et al. (2004) Characterization of surfactin from Bacillus subtilis for application as an agent for enhanced oil recovery. Appl. Biochem. Biotechnol., vol. 115, n. 4, p [3] Mulligan, C. N., et al. (1999) Metal removal from contaminated soil and sediments by the biosurfactant surfactin. Environ. Sci. Technol., vol. 33, n. 10, p [4] Cooper, D. G., et al. (1981) Enhanced production of surfactin from Bacillus subtilis by continous product removal and metal cation additions. Appl. Environ. Microbiol. vol. 42, n. 2, p [5] Divakaran, D., et al.(2011), Comparative study on production of alfa-amylase from Bacillus licheniformis strains. Braz. J. Microbiol., vol 42,n. 4, p [6] Youssef, H. H., et al. (2005) Importance of 3- hydroxy fatty acid composition of lipopeptides for biossurfactant activity. Appl. Env. Microbiol., vol. 71, n. 12, p Anais do XIX Encontro de Iniciação Científica da PUC-Campinas ISSN