Culturas Celulares (fermentação)

Transcrição

1 Culturas Celulares (fermentação) Carlos Sinogas 2015 / 2016

2 - Substrato para produção de proteínas recombinantes (humanas) - Células procarióticas (E.coli) - Células eucarióticas - Leveduras - Insectos - Mamíferos

3 - Tipos - Culturas primárias - Fragmento de tecido - Amostra de sangue - Culturas contínuas (transformadas) - Crescimento - Monolayer - Suspensão

4 - Estaminais Medicamentos de Biotecnologia - Não diferenciadas, pluripotentes - Precursoras - Não diferenciadas, comprometidas - Diferenciadas - Epiteliais (aderentes, poligonais) - Linfoblásticas (suspensão, esféricas) - Fibroblásticas (aderentes, alongadas)

5 - Inócuo (ATCC) Medicamentos de Biotecnologia - Equipamento - Garantia de assepsia - Meio de cultura - Simples (composição definida)

6 - Meio basal (nutrientes) - Eagle s minimal essential medium (MEM) - Soro fetal - Hormonas e factores de crescimento (FCS) - L-glutamina - Aminoácido essencial (lábil) - Glucose - Antibióticos - Indicador de ph (vermelho de fenol) - Tripsina

7 - Temperatura - 37ºC (mamíferos), outra... - ph - Tampão CO 2 /bicarbonato (estufa CO 2 ~10%) - Oxigénio - Aerobiose (CO 2 ) - Densidade /cm 2 ; 10 5 /ml - Área de contacto / volume de meio - Fase de crescimento - Logarítmica tardia (não estacionária) - Agitação - Homogeneização / rotura das células (suspensão)

8 - Observação microscópica / morfologia - Efeitos citopáticos - Taxas de crescimento celular - Eficiência de plaqueamento - Expressão de funções celulares - Taxa de secreção de proteína, p. ex.

9 - Células totais Medicamentos de Biotecnologia - Hemacitómetros - Células viáveis - Coradas - Exclusão de corante (azul de tripano)

10 - Produção de proteínas recombinantes Medicamentos de Biotecnologia - Objectivo medicamento - Investigação básica e aplicada diversa - Taxas de produção - Estudos nutricionais - Efeito de drogas (ligação a receptores, p. ex.) - Avaliação de citotóxicos

11 - Cultura em aderência Medicamentos de Biotecnologia - Multiplicação de placas / frascos (rollers) - Fábricas de células (sanduíches múltiplas) - Cultura em suspensão - Fermentadores

12 - Cultura em batch Medicamentos de Biotecnologia - Volume de meio fixo - Cultura em fed-batch - Adição gradual de meio (aumento de volume) - Cultura em batch semi-contínua Adição de meio e remoção de meio e células (a intervalos) - Cultura contínua - Adição de meio e remoção de meio e células (contínua) - Cultura em perfusão - Adição e remoção de meio (a intervalos)

13 - Estabelecimento de bancos - Estabilidade da construção - Consistência na produção - Criopreservação

14 - Questões Medicamentos de Biotecnologia - Formação de cristais de gelo (DMSO; glicerol) - Choque osmótico (1ºC/min até -70ºC) - Longa duração a -196ºC (azoto líquido) - Procedimento - Número de células (> 10 7 ) 1% eficiência - Tripsinizar, centrifugar, suspender 1 ml - Adicionar crioprotector - Uma noite em contentor isolante a -70ºC (1 cm esferovite) - Transferir para azoto líquido

15 - Questões Medicamentos de Biotecnologia - Rápido aquecimento à temperatura ambiente - Desinfecção exterior da ampola - Diluição das células em meio pré-aquecido - Procedimento - Adicionar a >10x volume (conc. ~10 5 /ml) - Incubar até ~10 7 (6-7 duplicações) 1 semana (10 5-2x10 5-4x10 5-8x10 5-1,5x10 6-3x10 6-6x )

16 - Centrifugar células (fase logarítmica tardia) - Contar células viáveis - Ressuspender à concentração adequada com meio novo - Incubar -...

17 - Decantar meio sobrenadante - Adicionar 1/10 de solução de tripsina (0,25%) - Incubar 10 minutos a 37ºC - Contar células viáveis - Ressuspender à concentração adequada - Incubar

18 - Cultura em suspensão Medicamentos de Biotecnologia - Optimização quantitativa - Células adaptadas a crescimento sem soro - Segurança biológica/viral - Purificação facilitada - Aumento de produtividade - Clonagem de células com rendimento aumentado - Expansão máxima da biomassa - PDL limite

19 Purificação da Substância Ativa Carlos Sinogas 2015 / 2016

20 - Centrifugação Medicamentos de Biotecnologia - SA associada às células - SA secretada - Resuspensão das células (no tampão apropriado para o passo seguinte) - Ultrafiltração / Diafiltração de sobrenadante - Concentração da SA - Troca de tampão para passo seguinte

21 - Cromatografia de afinidade Medicamentos de Biotecnologia - Cromatografia de exclusão molecular - Cromatografia de troca iónica - Troca aniónica - Troca catiónica - Redução quantitativa de impurezas - Redução qualitativa de impurezas - Redução de volumes (concentração)

22 (Aditivos aos passos de purificação) Medicamentos de Biotecnologia - Tratamentos a baixo ph - Tratamentos com solventes / detergentes - Nanofiltrações moleculares

23 - Diálises (diafiltração) - Substituição dos solventes pelos excipientes do produto final - Esterilização terminal - Filtração 220 nm / 245 nm - Conservação até fabrico do produto final - Congelação / refrigeração

24 Fabrico do produto final Carlos Sinogas 2015 / 2016

25 - Enchimento automático dos frascos / ampola / seringas pré-cheias - Filtração estéril on-line - Liofilização - Quando adequado (raro) - Fechar e rotular embalagem primária - Distribuição pelas embalagens secundárias - Quarentena - Até libertação pelo Controlo de Qualidade - Comercialização / utilização clínica