III - TESTES PARA A IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS

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1 III - TESTES PARA A IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS INTRODUÇÃO Os α-aminoácidos fundamentais utilizados pelas células para a biosíntese das proteínas apresentam características estruturais diferentes. Em parte são essas diferenças que permitem que as proteínas desempenhem papéis muito variados nos seres vivos. Todos os α-aminoácidos fundamentais contêm na sua estrutura um grupo funcional amino e um grupo funcional ácido carboxílico ligados a um mesmo átomo de carbono, conhecido por carbono α. Esses grupos funcionais deixam de existir nesta forma quando os aminoácidos são ligados uns aos outros para originarem a molécula de uma proteína (ficando apenas um grupo amino na extremidade inicial da cadeia polipeptídica e um grupo ácido carboxílico na extremidade final ). De facto são substituídos pelos grupos peptídicos, que resultam do estabelecimento das ligações entre os resíduos dos aminoácidos, ou seja, entre o que resta dos aminoácidos na estrutura da proteína. Fórmula geral de um aminoácido Ligação peptídica Exemplo de um tripeptídeo (AlaAlaAla), em que L = -CH 3 Os resíduos dos α-aminoácidos diferem uns dos outros apenas na sua cadeia lateral (L), também ligada ao carbono α. As diferenças de estrutura dessa cadeia lateral resultam em diferenças de certas propriedades físico-químicas, que podem ser testadas de uma forma simples. Como exemplos, podem referir-se os seguintes: (i) a solubilidade em água está relacionada com a hidrofilicidade e a capacidade de estabelecimento de ligações de hidrogénio; (ii) a deslocalização electrónica, como a que se verifica nos anéis aromáticos da tirosina e do triptofano, conduzem à existência de um máximo de absorção da radiação electromagnética na região do ultravioleta próximo (λ máx ~ 280 nm) para estes aminoácidos e para as proteínas que os contêm; (iii) os grupos funcionais de natureza distinta que existem nas cadeias laterais (por exemplo, grupo tiol na cisteína ou grupo indole no triptofano) permitem a sua identificação por meio de reacções características que conduzam ao aparecimento de precipitados ou de produtos corados. OBJECTIVO DO TRABALHO O trabalho consiste na realização de um conjunto de testes simples de natureza variada, que exploram as diferenças existentes entre as características estruturais dos aminoácidos, das proteínas e de outras substâncias. Alguns destes testes têm aplicação na determinação quantitativa de proteínas em solução aquosa. Para concretizar o trabalho será feita a identificação de um conjunto de substâncias sólidas que são apresentadas em tubos rotulados com as letras A, B, C, D, E, F, G, H, I e J e que correspondem aos seguintes compostos biológicos, não necessariamente pela ordem indicada: glucose, glicina, cisteína, ácido aspártico, lisina, arginina, tirosina, triptofano, prolina e albumina sérica. 1

2 REAGENTES Reagente para o teste do biureto (dissolução de 1,5 g de CuSO 4 5H 2 O + 6 g de NaKC 4 H 4 O 6 4H 2 O tartarato duplo de sódio e potássio, sal de Rochelle em cerca de 500 ml de água, adição com agitação de 300 ml de solução de NaOH a 10% (p/v) e diluição a 1 L com água destilada); Reagente de Coomassie (dissolução de 0,1 g de Azul Brilhante de Coomassie G250 em 47,0 g de etanol, adição de 85,0 g de ácido fosfórico e diluição a 1 L com água destilada); Solução de ninidrina a 2 % (p/v) em etanol a 95 % (v/v); Ácido nítrico concentrado; Reagente de Millon (dissolução de 15 g de sulfato de mercúrio (II) em 100 ml de ácido sulfúrico a 15 % (v/v)); Solução aquosa de nitrito de sódio a 1 % (p/v) Reagente de Hopkin-Cole (colocação de 10 g de Mg em pó num Erlenmeyer, adição de água até cobrir o metal, adição com agitação de 250 ml de solução aquosa saturada de ácido oxálico, filtração, acidificação com ácido acético diluído e diluição a 1 L com água destilada); Ácido sulfúrico concentrado; Solução aquosa de acetato de chumbo 2 M; Solução aquosa de hidróxido de sódio a 40 % (p/v); Solução de α-naftol a 1 % (p/v) em etanol; Água de bromo. MATERIAL tubos de ensaio mm banho de água a 100 ºC cronómetro espectrofotómetro UV-Vis tubos de ensaio mm banho de água-gelo buretas e pipetas de diversos volumes medidor de ph e eléctrodos TÉCNICA (resumo) 1) Escrever na folha de resultados as fórmulas químicas estruturais para os aminoácidos glicina, cisteína, ácido aspártico, lisina, arginina, tirosina, triptofano e prolina (para a forma predominante em solução aquosa a ph 7), 2) Realizar os ensaios descritos a seguir para as amostras A, B,, J. Logo que identificar inequivocamente uma amostra, não realizar mais ensaios para essa amostra, 3) Preencher uma tabela com os resultados dos ensaios, 4) Concluir sobre a identidade de cada uma das amostras A, B,, J. ENSAIOS Observação prévia Alguns dos ensaios que envolvem adição de ácidos ou bases fortes, ou aquecimentos em banho de água têm riscos de projecção de líquidos que podem provocar queimaduras graves. Deve ter cuidados adicionais na realização desses ensaios (normalmente são feitos nas hotes ), usar sempre óculos de protecção e confirmar que alguém próximo não corre também o risco de sofrer as consequências de um acidente. 2

3 I Solubilidade em água 1) Cada uma das amostras A, B,, J é apresentada num tubo contendo cerca de 10 mg da substância sólida. 2) Transferir o conteúdo de cada tubo para um tubo de ensaio mm (seco), previamente marcado com a letra correspondente à amostra e adicionar 15 ml de água destilada. 3) Tentar dissolver o sólido agitando suavemente. 4) Tomar nota do resultado de cada tentativa: dissolução rápida (+), dissolução mais difícil ( ) ou impossibilidade de dissolução (0). 5) Pipetar 0,5 ml de cada solução para cada um de dez tubos de ensaio 16 x 160 mm marcados com a letra correspondente à amostra e adicionar a cada um deles 9,5 ml de água destilada. Homogeneizar cada solução por agitação. Estas novas soluções, obtidas por diluição 1:20 a partir das soluções anteriores, serão designadas por soluções diluídas na descrição dos ensaios que se segue. II ph da solução aquosa As cadeias laterais de alguns aminoácidos possuem grupos funcionais com características ácidas (por exemplo, ácidos aspártico e glutâmico), isto é, têm tendência para doar protões a moléculas de água em solução aquosa; para outros aminoácidos (por exemplo, lisina e arginina) os grupos funcionais das cadeias laterais comportam-se como bases, isto é, captam protões fazendo com que o ph da solução seja superior ao da água. 1) Medir o ph de cada uma das soluções preparadas em I 2). Lavar o eléctrodo depois de cada medida; 2) Tomar nota do valor de ph medido para cada solução. III Absorção da radiação electromagnética a 280 nm O espectro de absorção da radiação electromagnética para a tirosina, o triptofano e, de uma forma geral as proteínas (que contêm estes aminoácidos) apresenta um máximo ao comprimento de onda de ~ 280 nm. 1) Ler a absorvância da solução amostra diluída ao comprimento de onda de 280 nm. 2) Tomar nota do valor de absorvância lido. IV Teste do biureto As soluções aquosas de compostos contendo duas ou mais ligações peptídicas (por exemplo, proteínas) dão origem ao aparecimento de uma cor violeta característica quando tratadas com uma solução diluída de sulfato de cobre em meio alcalino. O nome do teste vem do composto biureto que dá uma reacção tipicamente positiva. A cor é devida à formação de um complexo em que o ião cobre se coordena a quatro átomos de azoto das ligações peptídicas. O método do biureto, um dos que se usam para a determinação quantitativa de proteínas (para concentrações finais de proteína entre 0,1 e 2 gl 1 ), tem como base o desenvolvimento de uma cor violeta em solução aquosa resultante da reacção da proteína com o reagente mencionado. 1) Colocar 1 ml da solução amostra num tubo de ensaio, adicionar 1 ml do reagente para o teste do biureto e misturar bem. 3

4 2) Observar o eventual aparecimento de uma cor distinta da cor do reagente. 3) Caso não observe mudança, junte mais 1 ml do reagente para o teste do biureto e voltar a misturar bem a solução e a observar a cor. POSITIVO: Cor violeta. H 2 N C NH C NH 2 O O Biureto O C C O \ / N(H) N(H) / \ CH CH Cu 2+ O C C O \ / N(H) N(H) / \ CH CH V Teste de Bradford A existência de substâncias corantes que mudam de cor por ligação a determinados tipos de compostos em solução aquosa permite, em certos casos, a sua detecção e até mesmo a sua quantificação. O Azul Brilhante de Coomassie G-250 é um destes corantes; a sua ligação a uma proteína em meio ácido conduz a uma variação no comprimento de onda do máximo de absorção do corante de 465 nm para 595 nm com o consequente aparecimento de um tom azulado na solução avermelhada. O método de Bradford é muito utilizado para a determinação quantitativa de proteínas em solução aquosa numa gama de concentrações cerca de cem vezes mais baixas do que o método do biureto. 1) Colocar num tubo de ensaio 2 ml de reagente de Coomassie. 2) Adicionar 50 µl da solução amostra diluída ao tubo de ensaio que contiver o reagente de Coomassie e agitar suavemente. 3) Observar a eventual mudança de cor da solução. POSITIVO: Aparecimento de uma tonalidade azulada. VI Teste da ninidrina O teste da ninidrina é um teste geral para aminoácidos, podendo ser usado de uma forma qualitativa, em geral para detectar a presença de aminoácidos em meios de suporte para cromatografia ou electroforese (ver Electroforese de Aminoácidos), ou de uma forma quantitativa (por exemplo, para dosear aminoácidos após separação cromatográfica de hidrolisados proteicos, na determinação da composição em aminoácidos de proteínas). A reacção dos aminoácidos com a ninidrina origina um composto de cor azulada para todos eles com excepção da prolina, que dá origem a um composto de cor amarela. Colocar 2 ml da solução amostra num tubo de ensaio. Adicionar 1 ml da solução de ninidrina e agitar suavemente. 4

5 No caso de não verificar a formação de um composto corado, aquecer à fervura num banho de água durante 10 segundos (cuidado). Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor. POSITIVO: Cor azulada para aminoácidos em geral; cor amarela para prolina. VII Reacção xantoproteica É um teste para a tirosina e triptofano, ou proteínas que contenham estes aminoácidos baseado na reacção de nitração dos anéis aromáticos pelo ácido nítrico concentrado. Colocar 2 ml da solução amostra num tubo de ensaio. Adicionar cuidadosamente 1 ml de ácido nítrico concentrado. No caso de não verificar a formação de um composto corado, aquecer à fervura num banho de água durante 2 minutos. Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor. POSITIVO: Cor amarelada. VIII Teste de Millon É um teste para compostos contendo monohidroxibenzeno (ou seja, com grupos fenólicos, como é o caso da tirosina). Colocar 1 ml da solução amostra num tubo de ensaio. Adicionar 5 gotas do reagente de Millon e agitar com cuidado. Aquecer à fervura num banho de água durante 10 minutos (cuidado!). Arrefecer o tubo em água corrente e adicionar 5 gotas da solução de nitrito de sódio. Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor. POSITIVO: Cor avermelhada. IX Teste de Hopkin-Cole É um teste para compostos contendo o grupo indole (ex. triptofano), em que o reagente é o ácido glioxílico (CHOCOOH) em ácido sulfúrico concentrado. Colocar 3 ml da solução amostra num tubo de ensaio. Adicionar 1 ml do reagente de Hopkin-Cole e agitar (atenção, o reagente contém H 2 SO 4 bastante concentrado). Adicionar cuidadosamente e lentamente uma pequena quantidade de ácido sulfúrico concentrado, deixando-o escorrer pela parede interna do tubo (que deverá estar inclinado a 45º), de modo que se formem duas fases. Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor na zona de junção dos dois líquidos. POSITIVO: Anel azulado. X Teste de Sakaguchi É um teste para compostos contendo o grupo guanidilo (arginina). Colocar 3 ml da solução amostra num tubo de ensaio. Adicionar 1 ml da solução de hidróxido a 40 % (p/v) e agitar com cuidado. 5

6 Adicionar 2 gotas da solução de α-naftol e agitar com cuidado. Adicionar 5 gotas de água de bromo (na hote, o bromo é tóxico). Tomar nota do eventual aparecimento de uma cor. POSITIVO: Cor vermelha. XI Teste do sulfureto de chumbo É um teste para aminoácidos sulfurados (cisteína) ou proteínas que os contenham. Colocar 2 ml da solução amostra num tubo de ensaio. Adicionar 2 ml da solução de hidróxido de sódio a 40 % (p/v) e agitar com cuidado. Ferver em banho de água durante 2 minutos (cuidado com as projecções). Arrefecer o tubo em água corrente e depois num banho de água e gelo. Adicionar 2 gotas da solução de acetato de chumbo e agitar com cuidado. Tomar nota do eventual aparecimento de um precipitado ténue. POSITIVO: Cor acastanhada ou precipidato castanho ténue. BIBLIOGRAFIA R.L.. Shriner, R.C. Fuson, D.Y. Curtin, T.C. Morrill, The Systematic Identification of Organic Compounds A Laboratory Manual, 6ª ed. (ou outra) John Wiley & Sons, New York, A.I. Vogel, A Text-Book of Practical Organic Chemistry, including Qualitative Organic Analysis, 3ª Ed., Longmans, London, C. Dickson, Medicinal Chemistry Laboratory Manual, CRC Press, London,

7 TESTES PARA A IDENTIFICAÇÃO DE AMINOÁCIDOS E PROTEÍNAS FOLHA DE RESULTADOS GRUPO: DATA:... TURMA:... Nome... Nº... Nome... Nº... Nome... Nº... Escreva as fórmulas químicas estruturais para os aminoácidos utilizados como amostras (para a forma predominante em solução aquosa a ph 7). Glicina (Gly) Cisteína (Cys) Ácido Aspártico (Asp) Lisina (Lis) Arginina (Arg) Tirosina (Tyr) Triptofano (Trp) Prolina (Pro) 7

8 RESULTADOS DOS ENSAIOS A B C D E F G H I J I II III IV V VI VII VIII IX X XI 8

9 Amostra Identificação A B C D E F G H I J Comentários: 9