Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra. Alguns testes para identificação de enterobactérias

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1 Departamento de Zoologia da Universidade de Coimbra MICROBIOLOGIA António Verissimo Paula Morais Alguns testes para identificação de enterobactérias A família Enterobacteriaceae inclui bactérias Gram (-), facultativas que em condições anaeróbias fermentam hidratos de carbono, formando vários tipos de produtos finais. Consoante a natureza desses produtos finais do metabolismo fermentativo reconhecem-se dois subgrupos de enterobactérias: 1- Enterobactérias que fermentam a ácidos mistos. 2- Enterobactérias que fermentam a butanodiol. Testes IMViC Os testes designados por IMViC (Indol, vermelho de Metil, Voges-Proskauer e Citrato) constituem uma bateria de quatro testes bioquímicos fundamentais para diferenciar enterobactérias. 1- Teste de produção de Indol Este teste permite qualificar este tipo de bactérias segundo a sua capacidade de utilizar o aminoácido triptofano como fonte de carbono e, ou energia. Algumas enterobactérias possuem uma enzima chamada triptofanase que cataliza a remoção do grupo indólico do triptofano. Assim enquanto indol acumula no meio de cultura, como desperdício, o resto da molécula de triptofano é transformado a piruvato e usado para satisfazer as necessidades nutricionais da bactéria. A produção de indol, a partir de triptofano, pode então ser detectada cultivando os microrganismos num meio rico no aminoácido; triptona (digerido pancreático de caseína) é constituída por inúmeros polipeptideos que contêm muitos resíduos de triptofano. A acumulação de indol no meio pode ser depois detectada adicionando reagente de Kovac, que reagindo com o indol forma na superfície do meio um composto vermelho, não solúvel em água. 1

2 - Com uma ança estéril, inocular cada uma das enterobactérias em meio de triptona 1,5%. - Incubar as culturas a 37 C, durante 48 h. - Adicionar 0,5 ml de reagente de Kovac ao meio de cultura. - Agitar suavemente. Resultado positivo (presença de indol) - composto vermelho / violeta Resultado negativo (ausência de indol) - reagente de Kovac não altera a sua cor. 1.a. Reagente de Kovac p-dimetilaminobenzaldaído butanol HCl concentrado 3.0 g 75 ml 25 ml 2. Teste do Vermelho de Metil Este teste é usado para detectar as enterobactérias que utilizam a fermentação a ácidos mistos. Como se referiu, algumas enterobactérias fermentam glucose (ou outros hidratos de carbono) produzindo grandes quantidades de ácidos, que baixam o ph do meio de cultivo para além de 5. A adição do indicador - vermelho de metil permite detectar esse abaixamento do ph. O vermelho de metil é vermelho quando o ph é inferior a 5,5; apresenta cor amarela se o ph for superior a 6. Bactérias fermentadoras a ácidos mistos podem então ser detectadas se forem cultivadas num meio pouco tamponizado, com glucose e, se depois de um conveniente período de incubação se adicionar vermelho de metil ao meio de cultivo. - Com uma ança estéril, inocular cada uma das enterobactérias em meio MR-VP ( Metyl Red- Voges Proskauer). - Incubar as culturas a 37 C, durante 48 h. - Retirar cuidadosamente 1 ml da cultura para um tubo de ensaio. 1 - Adicionar, à restante cultura, 5 gotas da solução de vermelho de metil. - Agitar muito suavemente. 1 É nesta porção da cultura que se realizará o teste de Voges-Proskauer. Por isso deve assegurar-se que realizou este passo antes de prosseguir com a realização do teste do vermelho de metil. 2

3 Resultado positivo - desenvolvimento de cor vermelha (não laranja) imediatamente a seguir à adição do reagente. Resultado negativo - a cultura adquire cor amarela ou laranja. 2.a. Meio MR-VP peptona tamponizada K 2 HPO 4 glucose 7,0 g 5,0 g 5,0 g por litro 2.b. Solução de vermelho de metil vermelho de metil etanol 95% H 2 O 0,1 g 300 ml 500 ml 3. Teste de Voges-Proskauer Este teste permite identificar as enterobactérias que utilizam a fermentação a butanodiol. Neste caso o principal produto acumulado é o 2,3 butanodiol; no entanto, o teste detecta a presença de acetoína (intermediário metabólico na síntese de butanodiol) no meio de cultivo. A acetoína (acetilmetilcarbinol) na presença de KOH forma uma solução cor de rosa; a adição de a-naftol acelera esta reacção. Uma vez que, em presença de oxigénio, 2,3 butanodiol é retro-oxidado a acetoína, a intensidade da reacção é aumentada pelo arejamento da solução. 3

4 - Adicionar a cada um dos tubos com 1 ml (retirados em 2.) 0.6 ml de a-naftol a 5% em etanol absoluto. - Agitar cuidadosamente. - Adicionar 0.2 ml de uma solução aquosa de KOH a 40%. - Agitar cuidadosamente de forma a arejar a cultura. - Incubar os tubos por um período de 15 a 60 min. Os tubos devem ser incubados inclinados para aumentar a superfície do meio exposta ao ar (a reação é dependente de O 2 ). Resultado positivo- O resultado é positivo se for detectada a presença de acetoína no meio. Neste caso, desenvolve-se uma cor vermelha na superfície da cultura. Resultado negativo- A cultura mantém uma cor homogénea castanha. 4. Teste de Citrato Este teste permite determinar a capacidade das enterobactérias em utilizar citrato como fonte de carbono e energia, quando são cultivadas em condições aeróbias. O meio de Citrato de Simmons contém citrato como única fonte de carbono e amónia como fonte de azoto. Ao utilizar o citrato, o microorganismo remove o citrato do meio levando à acumulação de sódio e de alguma maneira à deslocação do ph, basificando o meio de cultivo. Este facto pode ser facilmente visualizado pela viragem de cor do indicador (bromotimol azul) presente no meio de cultivo. - Com uma ança estéril, inocular cada uma das enterobactérias em meio de Agar de Simmons. - Incubar as culturas a 37 C, durante 48 h. Resultado positivo - meio de cultura apresenta cor azul. Resultado negativo - meio de cultura apresenta cor verde (cor inicial). 4.a. Agar de Simmons 4

5 citrato de sódio NH 4 H 2 PO 4 NaCl MgSO 4 K 2 HPO 4 bromotimol azul agar 2.0 g 1,0 g 5,0 g 0,2 g 1,0 g 0,08 g 15,0 g por litro Sistema de identificação rápido Em caso de doença (e não só) é, por vezes, necessária a identificação rápida de um determinado microrganismo. A identificação de uma bactéria envolve a utilização de uma série de meios selectivos ou diferenciativos, com períodos de incubação entre 24 e 96 horas. Há, ainda, a somar a este período o tempo de preparação e feitura de meios. Para resolver estes problemas e acelerar a identificação de um microrganismo, utilizam-se sistemas multiteste miniaturizados. Existem vários destes sistemas à venda no mercado. São constituídos por tubos ou tiras de plástico com compartimentos que contêm vários tipos de meios de cultura. Permitem, assim, a realização simultânea de uma série de testes com a consequente caracterização da bactéria. Estes sistemas estão optimizados para fornecer à bactéria condições optimas de modo a que o resultado seja rápido e seguro. A maioria dos fabricantes destes sistemas fornecem um modo de identificação automático. Vai ser utilizado o sistema API tipo 20E concebido para identificação de Enterobacteriaceas (e outras bactérias Gram-negativas, isoladas de espécimes clínicos), desenvolvido e manufacturado por Analytab Products, Inc. O sistema é composto por 20 câmaras cada uma constituída por um tubo com cúpula. Cada tubo contém um meio desidratado de cultura diferente específico para cada teste. A galeria é inoculada (e os meios re-hidratados) com uma suspensão em salina da bactéria que se pretende identificar. O sistema, após inoculação, é incubado a 35 C e lido 18 a 24 horas depois. A identificação é feita após determinação do perfil. O perfil é um número com 7 dígitos (cada digito corresponde a um cálculo do resultado de 3 testes) que descodificado no Index de Perfis fornece a identificação da bactéria. 5

6 1- Utilize uma cultura, em meio sólido, da bactéria que quer identificar. A cultura deve estar pura, com colónias bem isoladas e não ter mais de 24 horas de incubação. 2- Faça uma coloração de Gram utilizando parte (1/3) de uma colónia bem isolada. 3- Faça o teste da oxidase utilizando mais um pouco da colónia. Para tal, coloque 2 gotas de uma solução de N,N,N',N'-tetrametil-p-fenildiamina (TMPD) a 1%(mantida no escuro) num papel de filtro; retire um pouco da colónia com um palito estéril e esfregue no papel de filtro. O teste é positivo se houver desenvolvimento rápido (até 10s) de uma cor azul. 4- Prepare a suspensão da bactéria para inocular a galeria: - retire, com uma ança estéril, um pouco da colónia escolhida e resuspende-a num tubo com 5 ml de salina (0,9% NaCl). A suspensão deve ficar ligeiramente turva. 5- Prepare a galeria: - Coloque no fundo da caixa de incubação, 5 ml de água desmineralizada (para humidificar o ambiente) e tape. - Retire a galeria, de uma forma asséptica, e coloque-a dentro da caixa de incubação. 6- Inocule a galeria: - Abra a caixa e incline ligeiramente a galeria. - Utilizando uma pipeta de pasteur, encha com a suspensão os tubos e as cúpulas das câmaras assinaladas. Deve encher devagar sem tocar com a pipeta na cúpula e deitando a gota de lado para evitar a formação de bolhas de ar no fundo dos tubos. Encha só o tubo das outras câmaras. Encha, com parafina estéril, as cúpulas das câmaras com o nome sublinhado. - Tape a caixa de incubação com cuidado e ponha a incubar a 35 C por um período de 24 horas. 7- A partir da suspensão de inóculo da galeria e após inóculação desta, retire uma gota e espalhe numa caixa de Petri para verificar a pureza da suspensão. Incube a 35 C, 24 horas. 8- Para ler a galeria: - Leia e tome nota dos resultados de todos os testes que não requeiram 6

7 a adição de reagentes. Utilize, para tal, a tabela que lhe foi fornecida. Os resultados devem ser registados na folha própria fornecida. O teste da glucose deve ser positivo para que a bactéria seja considerada uma Enterobacteriacea. - Para ler os testes que requerem a adição de reagentes: - adicionar uma gota de 10% FeCl 3 ao teste TDA O desenvolvimento de uma cor castanha avermelhada é considerada uma reacção positiva. - A leitura do teste VP necessita da adição à câmara de uma gota de KOH a 40% e uma gota de 5% a-naftol. Uma mudança de cor para o vermelho indica uma reacção positiva. - A leitura do teste do indol é feita após adição de uma gota do reagente de Kovac à câmara IND. A formação de um anel vermelho indica uma reacção positiva. - O teste da redução de nitrato é feito na câmara GLU. Adicionar 2 gotas de ácido sulfanilico (0.8%) e 2 gotas de N,N,-dimetil-a-naftilamina (0.5%). O teste é positivo se houver desenvolvimento de uma cor vermelha ou produção de bolhas de gás. - Faça o teste da catalase adicionando uma gota de 1.5% H 2 O 2 à câmara MAN. A formação de bolhas de gás indica uma reacção positiva. 9- Para determinar o perfil da bactéria: - Dar o valor correspondente a cada teste. - Somar, dentro de cada quadrado, o valor dos testes positivos obtendo, desta forma, um novo número com 7 dígitos. - Procurar no Index de Perfis o perfil obtido e identificar a bactéria. 7